重组DNA-分子克隆技术.ppt
重组DNA技术Recombinant DNA Techniques,主要内容,基本知识实验流程实验操作相关问题,第1部分：基本知识,克隆与克隆化 克隆：指同一副本或拷贝的集合 克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。,DNA克隆 DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。,基因重组(gene recombination)是指DNA片段胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。又称为重组DNA技术(recom-binant DNA technology)。,相关酶类（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5磷酸基 与3羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口 封合，连接DNA片段（3）DNA聚合酶：a.合成双链cDNA中第二条链。b.缺口平移制做探针。c.DNA序列分析。d.填补3末端。（4）Taq酶：催化PCR反应，聚合DNA,（5）反转录酶：a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶进行填补（6）多聚核苷酸激酶：催化DNA 5羟基末端 磷酸化，或标记探针（7）碱性磷酸酶：切除DNA5末端磷酸基（8）末端转移酶：在3羟基末端进行同系多 聚核苷酸加尾。（9）DNA酶：切割DNA（10）RNA酶：切割RNA,目的基因 有时应用重组DNA技术分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物蛋白质。目的DNA有两种类型：cDNA和基因组DNA。cDNA是指在体外经反转录合成的、与RNA（通常指mRNA）互补的单链DNA，经聚合反应，单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA是指包含一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,载体：是指为“携带”感兴趣的外源DNA,实现外源 DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用 的一些DNA分子，是运载外源DNA有效进入受体 细胞内的工具。可分为克隆载体和表达载体。,克隆载体的条件：有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶 的切点，而且每种酶的切点只有一个；外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我 复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽 可能大的外源DNA片段；有利于选择的标记基因，可以很方便知道外源DNA 已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；具有促进外源DNA表达的调控区。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,表达载体 为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。,表达载体的条件 转录的启动子和终止子 核糖体结合位点 基因拷贝数 宿主细胞的翻译效率 表达蛋白在细胞中的稳定性,载体的类型：可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA等。,质粒（plasmid）载体是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1-3个抗药性基因，以利于筛选。,噬菌体（phage）载体（1）噬菌体DNA改造系统（2）M13噬菌体DNA改造系统其他载体 柯斯质粒 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体 病毒DNA改造的载体,第2部分：试验流程,（1）获得目的基因，选取合适载体；（2）基因与载体连接，形成重组DNA分子；（3）重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体 细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,第3部分：实验操作,第1步：目的基因的获取1化学合成DNA：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某 种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编 码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪 通过化学合成原理合成目的基因。,2基因组DNA：采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶 将染色体DNA切割成许多片段，继而将它们 与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体 菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA 分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染 色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，即 基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选 方法从众多的转化子菌株中选出含某一基因 的菌株，扩增分离得到目的基因。,3 cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成 与mRNA互补的 DNA，再复制成 双链cDNA片段，与适当载体连接后 转入受体菌，扩增 为cDNA文库。用 适当方法cDNA文 库中就可以筛选分 离到目的基因。,4聚合酶链式反应（PCR）：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向 DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚 合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环 自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合 成，使目的基因按指数增长。变性、退火、延伸三步曲 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互 补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的DNA 链,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得230（1.07109)个基因片段,5、几种重要的PCR衍生技术 反转录PCR技术 原位PCR技术 实时PCR技术,PCR扩增结果实例,第2步：克隆载体的选择 1.质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。,2.噬菌体：噬菌体、MB载体。可通过转染方 式将其DNA送入细菌体内进行增殖。目的基因 与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方 式，也可采用置换重组方式。3.柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。,4.病毒载体：TMV，CaMV，PVX等，瞬时表达常用。病毒增殖水平较高,可使伴随的外源基因高水平表达；病毒增殖速度快,外源基因在很短时间(通常在接种后12周内)可达最大量的积累；病毒基因组小,易于进行遗传操作,大多植物病毒可以通过机械接种感染植物,适于大规模商业操作;宿主范围广,一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难转化的单子叶、豆科和多年生木本植物,扩大了基因工程的宿主范围;病毒颗粒易于纯化,可显著降低下游生产成本。所以植物病毒是外源基因的瞬时高效表达载体。,第3步：外源基因与载体的连接 即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源 DNA与载体共价连接的。1粘性末端连接(1)同一限制酶切割位点连接 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。(2)不同限制酶切割位点连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端,粘端连接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,Hap,2平端连接 限制性内切酶作用产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,Alu,3同聚物加尾连接 同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与 多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移 酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后 进行粘性末端连接。,同聚物加尾连接,5,5,5,5,AAA,AAA,TTT,TTT,TdT酶,连接酶,4人工接头连接 由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷 酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行 连接。,人工接头连接,BamHI,BamHI,BamHI,第4步：重组DNA导入受体细胞 根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。1.感受态细胞。经一定方法处理(如CaCl2处理)后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。,2.转化、转染及感染。转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载 体DNA导入受体细胞。转染：以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬 菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受 体菌。感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体 DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,转化,第5步：重组体克隆的筛选和鉴定1直接选择法 直接法是针对载体携带某种或某些标志基因 和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直 接测定基因表型。（1）抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某 种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因 的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板 上幸存并形成菌落。,（2）标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌 表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷 互补，那么就可以利用营养突变菌株进 行筛选，这就是标志补救筛选。,2.酶切和电泳挑取单菌落，于液体培养基中培养；收集菌体，提取纯化质粒；对质粒进行限制性内切酶酶切；琼脂糖凝胶电泳检测；根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。,3.PCR和电泳 挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；单菌落于液体培养基中培养的菌液PCR；对提取的质粒进行PCR；,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,酶切鉴定结果实例图,4.分子杂交法 利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的 转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直 接选择并鉴定目的基因。原位杂交Southern印迹,5.免疫学方法 利用特异抗体与目的基因表达产物相互作 用进行筛选。包括：免疫化学方法、酶免 检测法,放射性抗体检测法,滤膜（固定抗体）,+,第6步：克隆基因的表达 1.表达载体的选择和构建2.受体细胞的建立和转化3.目的基因的表达及检测4.表达产物的分离和纯化5.表达产物的应用,1.表达载体的选择和构建（1）表达载体的选择 原核表达体系 大肠杆菌是当前采用最多的原 核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下 述标准：含大肠杆菌适宜的选择标志 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子 含适当的翻译控制序列和翻译起始点等 含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。,大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白 质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具 有活性尚需进行复杂的复性处理很难表达大量的可溶性蛋白。,2真核表达体系 与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。,3、转基因动植物 将目的基因构建在动植物表达载体上，然后转化到动植物体内，在适宜启动子的作用下，目的基因在体内获得高效表达。通常用的转基因植物的操作有农杆菌介导法、花粉管通道法和基因枪方法。,表达载体的构建,外源基因在受体细胞中的表达,重组子,目的基因的mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（E.coli）受体细胞,目的基因表达产物的检测,蛋白质的PAGE,对照 样品 Marker,基因表达检测实例图,目的蛋白的分离纯化,分子筛亲和柱离子交换抗原抗体,目的蛋白,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,相关问题,一、引物的设计1、引物设计原则（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。,（3）引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。（4）引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。（6）G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。,（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。（8）对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。,2、引物设计和评价软件 Premier Primer 5 Oligo 6 在线软件Oligonucleotide Properties Calculator,3、酶切位点的引入（1）载体序列和目的基因序列的分析。选择表达载体多克隆位点处具有的而目的序列内部没有的酶切位点，引入引物的5末端。（2）载体中引入序列后读码框的分析，避免出现移码（3）保护碱基的选择,（4）进行双酶切的两个酶的反应条件分析。包括酶切温度，缓冲液，酶切效率等。酶切位点分析常用软件Bioedit、Bioxm等,二、融合基因的构建,将两个不同的基因融合在一起，通过利用其中一个基因表达产物的功能，以更方便的研究另一个基因产物。如GST目的基因、His目的基因、荧光蛋白目的基因等。为保证各个基因产物的独立性和生物学功能，通常在两个基因中间插入一柔性链，柔性链选择为G-S即GGATCC的碱基序列或者为(G4S)3即碱基序列GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC,G为分子量最小的氨基酸，没有手性碳，侧链最短，空间位阻最小，能增加柔韧性；而丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，能增加亲水性，以保持两种蛋白的独立。这样通过插入一柔性Linker保持了两种蛋白各自的构象和功能。,三、载体的改造,1、在载体中引入酶切位点 在现有载体不能满足实验需求的情况下，即在分析目的基因后，确定载体上mcs处的酶切位点不能使用的情况下，可考虑在载体上引入其他的酶切位点。首先要分析载体的全序列，确保在载体的其他位点不具有该酶切位点。引入酶切位点后，要确保目的基因插入后不会发生移码,2、特定用途载体的构建 在已有载体的基础上，通过插入一些特定序列，来构建满足实验需求的载体。如在植物表达载体上引入抗性基因、荧光蛋白等，可用以抗性筛选和表达检测在载体上引入强启动子或增强子，使目的基因在特定组织中能够大量表达在普通载体上引入内含子和mcs，构建为专门用于RNAi的载体,
