酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生.ppt
第五章 酶分子修饰,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。包括物理修饰、化学修饰，分子改造等,一、酶修饰的作用1.稳定酶的天然构象与增强耐热性2保护酶活性部位与抗抑制剂3 维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4 降低酶的抗原性及稳定酶的微环境5 改变酶学性质,第一节 概述,二、酶修饰的方法化学修饰酶改造的分子生物途径酶分子的物理修饰,一、酶分子化学修饰的一般问题酶分子的化学修饰对酶结构与功能、酶的催化机制等酶学研究方面有着重要作用，而在酶工程中所运用的修饰方法与基础研究的要求有所不同。1选择酶分子修饰剂理想的修饰剂是选择性高、在温和反应条件下能进行修饰反应、被修饰的功能基在温和条件下能再生。,第二节 酶分子的化学修饰,能选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行；被标记的残基在酶中稳定，容易通过降解分离出来并鉴定；反应程度能用简单的技术测定。,选择修饰剂时要考虑几点：修饰剂的相对分子质量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性；修饰剂上反应基团的数目及位置；修饰剂上反应基团的活化方法与条件。,2选择反应条件 反应体系中酶与修饰剂的分子比例；反应体系的溶剂性质、盐浓度和pH条件；反应温度及时间。3修饰剂的活化活化基团才能在一定条件下与酶分子的某侧链基团进行反应,4修饰将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。5分离需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,二、金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子金属离子置换修饰的作用：,十一次课,三、酶分子侧链基团修饰功能基团主要有氨基、羧基、巯基咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等,各种氨基酸侧链的修饰剂,四、大分子结合修饰利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修饰方法，通常使用的水溶性大分子修饰剂有：右旋糖酐，PEG、肝 素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,非共价修饰,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍,共价修饰,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。(均相反应,无毒害)修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。,五、肽链有限水解修饰,利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。,a、胃蛋白酶原的激活,有限水解意味着水解酶量和时间相对少同时由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位置差异,氨基酸周围肽段引起的氨基酸pK值和电性变化,使同样氨基酸部位水解程度也可能不同,酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。,六、氨基酸置换修饰将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。修饰方法：化学修饰法、定点突变技术,通过各种物理方法使酶分子的空间结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。通过酶分子的物理修饰，可以了解在不同物理条件下特别是在高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH、有毒等极端环境下，由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。,第三节 酶分子的物理修饰,酶分子物理修饰的特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变。只是在物理因素的作用下，次级键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。酶分子空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下，首先使酶分子原有的空间构象破坏，然后在不同的物理条件下，使酶分子重新构建空间构象。,例如：首先用盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象被破坏，通过透析除去变性剂后，在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明：在20 的条件下重新构建的胰蛋白酶与天然酶的稳定性基本相同，而在50 的条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。,第四节 酶改造的分子生物学途径,一、工具酶限制性内切酶II型酶的识别序列通常为4-6bP，具有回文结构，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3末端突出的粘性末端(sticky end)。GAATTCDNA连接酶DNA聚合酶末端脱氧核苷酰转移酶,二、载体外源DNA本身没有自主复制能力，导入宿主细胞后不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA导人宿主细胞进行扩增成表达，就需要外源DNA与某种能在宿主细胞中进行自主复制和表达的DNA重组，并由其携带进入宿主细胞。这种可以用来插人外源DNA片段构建重组DNA分子，并将外源DNA携带进人宿主细胞的DNA称为基因克隆载体，简称为载体(Vector)。,三、基因突变技术根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。,1编码基因的专一性位点突变 专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。,(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 DNA模板的制备；寡核苷酸突变引物的设计和选择；突变引物与模板DNA的退火和延伸条件；DNA聚合酶的选择；底物对离体DNA合成反应的影响；受体细胞对突变体的产率的影响。,(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法,Kunkel 突变法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变,Kunkel 突变法当E.coli发生dUTP酶缺陷突变时(dut-)，由于这类细胞不能把dUTP转化为dUMP，所以细胞内的dUTP量大为增加，其中一些dUTP可以搀入DNA正常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。正常情况下，E.coli可以合成一种尿嘧啶-N-糖基化酶（ung），它可以去除搀入到DNA中的尿嘧啶。然而，当E.coli为ung-时，该酶失活，故尿嘧啶不能从DNA链中剔除，使细菌DNA中尿嘧啶含量增加。在dut-ung-F菌株中，这个比例有所提高。从而使得生长于这一菌株的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶。,先把想要诱变的质粒放到一个ung-突变型的E.coli里，做出一个T全部被U代替的单链DNA的“模子”，然后把这个模子和核苷酸一起放到适宜条件下培养（ATP、聚合酶等）。放进去的核苷酸除了想要诱变的位点以外，其它全和模子是碱基互补配对的，在DNA连接酶的作用下就会产生一个杂交的双链DNA，一条是模子，一条是定点诱变的产物。再把这个双链DNA放到ung+细菌体内让它把模子酶解掉，再以诱变产物为模板生产质粒，就得到了很多很多诱变过的质粒。,基于抗生素抗性“回复”的突变方法pALTER-1质粒的特征：多克隆位点；含有四环素抗性（Tetr）和氨苄敏感性（Amps）利用辅助噬菌体超感染,制备含目标基因的单链DNA作为突变模板DNA。,基于去除特定限制性酶切位点的突变,利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变利用PCR方法在基因的5或3末端区产生突变。该方法是利用PCR反应中，寡核苷酸引物序列被搀入到所产生的DNA分子的末端。所以，只要引物3端核苷酸序列能足够好地与模板序列相匹配，引发PCR反应，我们就可以改变引物上5端的序列。重叠延伸和基因突变（中心区产生突变）利用PCR技术在目标基因的中心区段引入位点特异性突变和产生重组DNA分子。当将重组延伸方法用以将不同的基因进行剪接和组合在一起时，称为gene SOEing，即通过重叠延伸进行剪接（splicing by overlap extension）。,利用上述原理，可以通过重叠延伸PCR技术对基因的中心区段进行取代、插入和缺失突变。,2盒式突变法,基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。,一、在酶学研究方面的应用1.酶活性中心的研究2.酶的空间结构研究3.酶的作用机制研究。,第五节 酶分子修饰的应用,二、在医药方面的应用在医药方面的应用主要体现在以下两个方面1.降低或消除酶抗原性 通过酶分子修饰可以显著降低甚至消除酶的抗原性2.增强医药用酶的稳定性,三、在工业方面的应用1.提高催化效率2.增强工业用酶的稳定性3.改变酶的动力学特性,三、在抗体酶研究开发方面的应用具有酶的催化活性的抗体，称之为抗体酶（abzyme）又称催化性抗体（catalytic antibody）。特点:抗体酶具有典型的酶反应特性：与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性具有高效催化性抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等抗体酶可催化多种化学反应,
