酶学与酶工程第六章酶的固定化.ppt

第六章 酶、细胞、原生质体的固定化,一、固定化酶（Immobilized Enzyme）1.定义：固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使之成为不溶于水的，但是仍具有生物活性的酶。催化反应后的酶可以回收重复使用。,第一节 酶的固定化,固定化酶优点：极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺；可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应，酶的使用效率提高，成本降低；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；较游离酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量。,固定化酶的缺点：由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损失；由于固定化需用载体，因而多了载体成本费及固定化操作费用；固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降；只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适宜。,必须注意维持酶的催化活性及专一性应该有利于生产自动化、连续化应有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利于反复使用固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或反应液发生化学反应固定化酶成本要低，以利于工业使用,二、固定化酶的制备原则,酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化方法有很多，但对任何酶都适用的方法是没有的，必须经过试验研究才能确定。酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法。,三、固定化方法,1.吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，,2.包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法）将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包埋法；将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因此可以应用于许多酶、微生物的固定化。,1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶，聚丙烯酰胺凝胶,2）微胶囊法 微胶囊固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球状体，比凝胶包埋颗粒要小得多，底物和产物扩散阻力较小，但是反应条件要求高，制备成本也高。,界面沉淀法或称相分离法 利用某些聚合物在水相和有机相溶解度极低而形成薄膜将酶包埋。界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶二级乳化法脂质体包埋法 由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶,3.结合法 选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。可分为离子键结合法，共价键结合法两种。,1）离子键结合法 在适宜的pH和离子强度条件下，酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法，因而也称离子交换吸附法。离子结合法的优点是：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺点是：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。,2)共价结合法共价结合法是指借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固定化方法。载体有：天然高分子衍生物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龙等,酶和载体的偶联反应有多种，取决于载体上的功能基团与酶分子上的非必需侧链基团。载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团间不具有直接反应的能力，所以要通过两类方法来解决：一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。,重氮反应是带芳香氨基的水不溶性载体的主要反应，载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基直接进行偶联,溴化氰法：对于带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等来说，这是最常用的反应。,芳香烃化反应：含羟基的载体也可在碱性条件下和三氯均三嗪等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚基或巯基等偶联。,叠氮反应：适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM纤维素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物等。,共价结合法的优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，这有利于连续使用缺点：该方法反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较激烈的反应条件，可能会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，其酶活回收率一股为30左右，有时甚至底物的专一性等酶的性质也会因固定化而发生变化,保护措施：应选择适宜的固定化方法与相应的载体，例如，采用重氮法时要注意载体的亲水性与疏水性，严格控制反应条件，提高反应的专一性，例如使反应局限于-氨基，保护-氨基，应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。,4.交联法交联法是指利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。它与共价结合法的不同之处是它不使用载体。,酶蛋白的功能团有N末端的氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基等双功能和多功能试剂根据它们的功能基团相同与不同可分为“同型”和“杂型”两类其中员常用的交联剂是戊二醛。,交联法的优点是操作简便，其缺陷则是交联反应的过程往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。1)采用某些保护措施 2)尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间，有利于固定化酶比活力的提高。,5.热处理法6.各种固定化酶方法的优缺点比较,1酶的活性 2酶的稳定性 固定化增加了酶活性构象的牢固程度 抑制酶的自身降解 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭,三、固定化酶的特性,固定化酶稳定性升高表现在以下方面 固定化增加了酶的耐热性 固定化增大了酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力 固定化减轻了蛋白酶的破坏作用 固定化可以增强贮存稳定性和操作稳定性,3酶的最适温度4酶的最适pH5酶的动力学特征6酶的作用专一性,1酶的活力固定化酶(细胞)的活力即是固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。固定化酶(细胞)的单位可定义为：每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量，,四、固定化酶的评价指标,测定方法分为间歇测定和连续测定两种 1)间歇测定 在搅拌或振荡反应器中，与溶液酶同样测定条件下(如均匀悬浮于保温的介质中)进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规酶活测定方法进行测定。2)连续测定 将固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。,2蛋白总量(1)双辛可宁酸法(BCA法)(2)考马斯亮蓝法3偶联率及相对活力偶联率(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)加入 蛋白活力X100 活力回收固定化酶总活力加入酶的总活力100 相对活力固定化酶总活力(加入酶的总活力一上清液中未偶联酶活力)X100,4半衰期固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。,将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。,第二节 细胞、原生质体固定化,一、固定化细胞的特点具有固定化酶的特定，同时又具有自身的优势：固定化细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好保持了细胞内的酶系统、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制,发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间固定化细胞密度提高，可以提高产率提高固定化工程菌的质粒稳定性,缺点：必须保持菌体的完整，防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解胞内多酶的存在，会形成副产物载体、细胞膜或细胞壁会造成底物扩散的障碍等,二、固定化细胞的分类,三、细胞固定化方法1包理法操作简便包埋条件温和形成的凝胶有一定的机械强度2.吸附法,四、固定化细胞的性质 一方面固定化对酶产生的某些影响同样对细胞起作用由于细胞内环境的相对恒定和细胞的“缓冲作用”，固定化对细胞胞内酶产生的影响在某些方面不像对游离的自然酶那样明显固定化细胞(内)酶除受固定化因素影响外，还受细胞结构及细胞膜透性的影响。,五、固定化细胞发酵产酶的特点1提高产酶率2可以反复使用或连续使用较长时间3基因工程菌的质粒稳定不易丢失4发酵稳定性好5缩短发酵周期，提高设备利用率6产品容易分离纯化7适用于胞外酶等胞外产物的生产,