配子与胚胎生物工程技术.ppt

第九章 配子与胚胎生物工程技术,刘 宏,配子与胚胎生物工程概述胚胎移植技术其他胚胎工程技术概述,配子与胚胎生物工程也称胚胎生物技术或胚胎工程技术，主要是对动物的卵子、精子和胚胎在体外条件下进行各种操作，以加速繁育经济动物，培育优良品种，或挽救濒危动物使用的一系列工程技术方法。,第一节 配子与胚胎生物工程概述,研究内容,胚胎移植胚胎冷冻保存体外受精动物克隆,转基因技术性别控制胚胎干细胞技术胚胎嵌合技术,胚胎移植,一、胚胎移植技术概述二、胚胎移植的意义三、国内外发展概况四、胚胎移植的基本原则五、牛胚胎移植操作步骤,一、胚胎移植技术概述,1.定义胚胎移植是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出（或通过体外受精及其他方式得到体外生产的胚胎），移植到另一头同种且生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。实际上是由产生良种胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的技术。,牛胚胎移植技术路线示意图,着床前早期胚胎的游离状态；不同个体（物种）早期胚胎发育内环境相似；不会发生免疫排斥,2.理论基础,二、胚胎移植的意义,充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群加速育种进程简化良种引进方法保存品种资源诱发单胎动物产双胎研究手段,三、国内外发展概况,胚胎移植技术是20世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术。1951年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛。1976年，牛非手术法胚胎移植获得成功。,1.胚胎移植历史,1890年 英国第一次兔获得胚胎移植成功1934年 绵羊1949年 山羊1951年 猪1951年 牛1970年 马1975年1月 美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会1980年代 欧洲使用MOET 奶牛育种,国际间胚胎贸易非常活跃，早在1994年，全世界仅胚胎移植牛就已超过350,000头，其中进出口的胚胎约占总数的10%。近年来，国际上胚胎的产量和贸易量则成倍增长。,2.发展前景,我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成。农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；胚胎移植技术作为扩大良种牲畜数量的一种最好手段，将在畜牧业生产中起到越来越大的作用，胚胎移植技术产业化前景十分广阔。,四、胚胎移植的基本原则,移植前后所处的环境应是相同或相似的移植的时间要适宜胚胎的发育应当正常,供体和受体在种属上必须一致；供体和受体在生理上必须一致：供、受体在发情时间上应同期化，一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降；从供体中收集胚胎的部位与给受体移植胚胎的部位必须一致：即从供体子宫角内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫角内。,1.移植前后所处的环境应是相同或相似的,胚胎收集与移植的时间不能超过周期黄体的寿命，因此，胚胎的收集时间不能超过发情配种后第7天，最好是在发情配种后的第5-7天内进行。,2.移植的时间要适宜,胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响。同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植。,3.胚胎的发育应当正常,五、胚胎移植操作步骤,供、受体牛的选择供体的超数排卵与人工授精受体的同期发情胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的移植,1.供、受体的选择,供体应是良种，而且为性状表现优秀、具有较高育种价值与遗传优势的个体；供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳；供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。,1.1 供体母畜的选择,一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型；要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同；应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群。,1.2 受体母畜的选择,2.1 超排定义在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称“超排”。,2.供体的超数排卵与人工授精,牛有PG+FSH法和CIDA+FSH法两种；发情后913天开始；常用的激素为FSH；注射方法一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时（半衰期短）；发情后812小时配种，间隔12小时再配种一次。,2.2 超数排卵方法,在发情周期第10、11、12、13天每头牛分别肌注FSH 160、140、110、90 单位（共500IU)，每天分两次注射，在第12天注射FSH的同时肌注PG，上午2支/头，下午1支/头。发情后供体AI或配种2-3次。,供体牛的超排方案,3.受体的同期发情,3.1 定义利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。,缩短黄体期的前列腺素法(PG法)延长黄体期的孕酮法,3.2 同期发情方法,PGF2有溶解黄体的作用，从而引起发情，所以只对卵巢上存在黄体的受体有效。在情期第9天以后，注射PGF2，常可在注射后2-3天内发情。对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔10-12天的两次注射法。此方法方便可靠，但费用较高。,3.2.1 前列腺素处理法,孕酮能够抑制腺垂体释放FSH，每日肌注或口服孕酮，或经阴道海绵栓给予孕酮或其类似物，一般处理12-18天后，可以抑制卵泡发育。停止处理或撤除海绵栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡发育，通常在2-3天内发情。为了提高排卵的效率，在孕激素处理结束的前一天，可以给予小剂量的FSH。此法费用低，但处理时间长。,3.2.2 孕激素处理法,4.1 冲胚液和保存液的制作冲胚液有很多种，目前最常用的为含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），也可用于体外短期保存胚胎。保存时间长或体外培养多用M-199液。,4.胚胎的收集,4.2 回收过程牛适宜于5-7日龄胚胎;现均采用二通管非手术采卵法：用直肠把握子宫颈法插入带有探针的二通管直至一侧子宫角的基部，通过打气孔注入8-10ml空气,抽出探针，通过中心管道反复注入-回收冲卵液,连续5-6次。同样方法冲另一侧子宫角。,子宫角回收的液体较多，可以通过专用胚胎漏斗除去多余的冲卵液，在连续变倍解剖显微镜（实体显微镜）下进行检胚；胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。,5.胚胎的检查和评定,A级;形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,透明带适中；B级;轮廓清晰,色调和细胞密度良好；C级;轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多；D级;轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液泡很多。,5.1 胚胎的分级标准,5.2 不同发育阶段的正常胚胎,5.3 未受精卵或异常胚胎,2-cell,4-cell,8-cell,16-cell,Morula,Blastocyst,5.4 正常胚胎的形态,6.胚胎的移植,重点应检查子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小），只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛，并记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧。牛站立保定于六柱栏保定架内，用2%盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用18号针头，每只牛约5ml。,6.1受体母牛的准备,1.1ml注射器 2.装管接头 3.细管A.棉塞 B.气泡、保护液.含胚段,装管器械和装管方法,6.2 胚胎的移植方法,直肠把握法,2003年9月4日降生的良种胚胎移植牛,（江苏省农业三项工程项目）,受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛,（江苏省农业三项工程项目）,外国专家来访,外国专家来访,胚胎冷冻体外受精动物克隆转基因技术,性别控制胚胎干细胞嵌合体技术,第三节 其他胚胎工程技术概述,胚胎冷冻,胚胎的冷冻保存，是将胚胎贮存在196超低温下长期保存的方法。20世记70年代试验成功是胚胎移植技术的重大突破，使胚胎移植不受时间和地点的限制，从而扩大了胚胎移植技术的效率。是长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施。,体外受精,试管动物技术即胚胎体外生产技术，是相对于体内胚胎而言的,是指卵母细胞在体外成熟后与获能的精子体外受精并分裂发育到桑椹胚或囊胚期(5-7天)的技术。,克隆定义clone，愿意为树木的枝条，在生物学中指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系。克隆=无性繁殖。,克隆技术,细胞核移植技术（NT），就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体，使得核供体的基因得到完全复制。依供体核的来源可分为：胚细胞核移植、胚胎干细胞核移植与体细胞核移植。,克隆技术,转基因技术,转基因动物就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入动物胚胎或配子，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。,性别控制技术,定义 性别控制指通过人为干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。对高效优质的发展畜牧业具有重要意义：可使受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉用、毛用性状等）能获得更大的经济效益；,干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞。,胚胎干细胞,嵌合体,嵌合体(chimera)一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽。中国的“龙”：九似 图腾“龙角似鹿、头似驼、眼似鬼、项似蛇、腹似蜃、鳞似鲤、爪似鹰、掌似虎、耳似牛”嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。,骡子天然嵌合体？,骡子：不是。是杂种,