分光光度法操作程序.docx

紫外可见分光光度法操作程序编制部门：质量部编号：S0P-QC083-03页数：1/7起草人审核人QA批阅批准人起草缘由：口新订口修订说明：年月日年月日年月日年月日分发部门质量部、化验室执行日期年月日目的：法律规范紫外-可见分光光度法操作。范围：适用于分光光度法测定。职责：检验有关人员。规程：分光光度法是通过测定被测定物质在特定波特长或肯定波长范围内的光汲取度，对该物质进行定性或定量分析的方法。常用的波长范围为：（1）200-40Onm的紫外光区；（2）400-76Onm的可见光区；（3）2.5-25um（按波数计为4000-400Cmj）红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子汲取分光光度计。为保证测量的精密度和精确度，全部仪器应依据我国计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质汲取的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=IglZT=ECL式中A为汲取度；T为透光率；E为汲取系数，采纳的表示方法是（Ecm）,其物理意义为当溶液浓度为1%（gml）,液层厚度为Icm时的汲取度数值；C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g；1.为液层厚度，cm。紫外可见分光光度法检验操作程序编制部门：质量部编号：S0P-QC083-03页数：2/7物质对光的选择性汲取波长，以及相应的汲取系数是该物质的物理常数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在肯定条件下的汲取系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有汲取外，许多物质本身并没有汲取，但可在肯定条件下加入显色试剂或结构处理使其显色后再测定，故又称比色分析。由于显色时的影响呈深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对比品同时操作。4.1 紫外分光光度法4.1.1 仪器的较正或检定由于温度变化对机械部分的影响，仪器的波长常常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面较正检定外，还应于测定前较正测定波长，常用汞灯中的较强谱线237.83nm/253.65nm、275.28nm>296.73nm>313.16nm>334.15nm、365.02nm、404.66nm435.83nm>546.07nm与576.96nm,或用仪器中的笊灯的486.02nm与656.IOnm谱线进行较正，玻璃在279.4nm、287.5nm>333.7nm>360.9nm418.5nm>460.0nm>484.5nm>536.2nm与637.5nm波特长有尖锐汲取峰，也可用波长校正用，但因来源不同会有微小的差别，使用时应留意。波长nm235（最小）257（最大）313（最小）350（最大）汲取系数E1'lcm124.5144.048.6106.6汲取系数的范围123.0-126.0吸光度的精确度可用重格酸钾的硫酸溶液检定，取在120干燥至恒重的基准重格酸钾约60mg,精密称定，用0.005molL硫酸溶液溶解并稀释至IOoomI,在规定的波特长称定并计算其汲取系数，并与规定的汲取系数比较，如上表，应符合表中的规定。紫外可见分光平度法检验操作程序编制部门：质量部编号SOP-QC083-03I页数:-3/7杂散光的检查可按下页表的试剂和浓度，配制成水溶液，置Icm石英汲取池中，在规定的波特长测定透光率，应符合表中的规定。试剂浓度%(gml)测定用波长nm透光率%碘化钠1.00220<0.8亚硝酸钠5.00340<0.84.1.2对溶剂的要求测定供试品前.，先应检查所用的溶剂在供试品所用的波长四周是否符合要求，即用ICm石英汲取池盛溶剂，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定其吸光度，溶剂和汲取池的汲取度,在220-24Onm范围内不得超过0.40,在241-25Onm范围内不得超过0.20,在251-300nm范围内不得超过0.10,在300nm以上时不得超过0.05。4.1.3 测定法测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对比，采纳Icm的石英汲取池，在规定的汲取峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度，以核对供试品的汲取峰波长位置是否正确，除另有规定外，汲取峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的精确度，并以吸光度最大的波长作为测定波长，一般供试品溶液的汲取度读数，以在03-0.7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品汲取带的半宽度，否则测得的汲取度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增加为准，由于汲取池和溶剂本身可能有空白汲取，因此测定供试品的吸光度后应减去空白读数，再计算含量。用作鉴别和检查项目的方法，分别按各品种项下的方法进行，鉴别项下吸光度读数的范围可依据制剂的实际含量和供试液的稀释倍数估算。用于含量测定的方法一般有以下几种。(1)对比品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对比品溶液，对比品溶液中所含测试成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100%±10%,所用溶剂也完全全都，在规定的紫外可见分光平度法检验操作程序编制部门：质量部编号:SOP-QC083-03页数：4/7波长测定供试品溶液和对比品溶液的吸光度后，按下计算供试品中被测溶液的浓度：Cx=（AxZAr）Cr式中CX=为供试品溶液的浓度；AX二为供试品溶液的汲取度；CR=为对比品溶液的浓度；AR=为对比品溶液的汲取度.（2）汲取系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波特长测定其吸光度，再以该产品在规定条件下的汲取系数计算含量.用本法测定时.，应留意仪器的校正和检定.先求出被测样品的Ekm%值，再与规定的Ekm%值比较，可计算出供试品的含量.E"ICN（样品）=式中A为供试品溶液测德的汲取度值；C为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数（gml）;1.为汲取池的光路长度（cm）._E生由（挂品）供试样品的含量%=E%cm（标准）X100式中（样品）为依据前式计算出供试品的百分汲取系数；E）Ce为药典或药品标准中规定的百分汲取系数.（3）计算分光光度法采纳计算分光光度法应慎重.本法有多种，使用时均应按各种项下规定的方法的方法进行.当吸光度处在汲取曲线的陡然提升或下降的部位测定时，波长的微小变化可对测定紫外可见分光光度法检验操作程序编制部门：质量部I编号：S0P-QC083-03页数：5/7结果造成显著影响，故对比品和供试品测试条件应尽可能全都，若测定时不用对比品，如维生素A测定法，则应在测定时对仪器作认真的校正和检定.（4）比色法用比色法测定时，应取对比品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对比品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。在规定的波特长测定对比品和供试品溶液的吸光度后，按紫外分光光度法项下（1）对比品比较法的计算供试品浓度。当吸光度和浓度关系不呈线性时，应取数份梯度量的对比品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液时，应取份梯度量的对比品溶液，用溶剂补充同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再依据供试品的吸光度在标准曲线上求出其含量。4.1.4 留意事项：（1）试验中所用的量瓶，移液管均应经检定校正、洗净后使用.（2）使用的石英汲取池必需洗净.用于盛装样品、参比及空白溶液的汲取池，当装入同一溶剂时，在规定波长测定汲取池的透光率，如透光率相差在30%以下者可配对使用，否则必需加以校正.（3）取汲取池时，手指拿毛玻璃面的两测.装盛样品溶液以池体积的4/5为度，使用挥发性溶剂时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭洁净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后残留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净.汲取池放入样品室时应留意每次放入方向相同.使用后用溶剂及冲洗洁净，晾干防尘保存，汲取池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3：1V/V）混合液浸泡后，洗净备用.如格酸钾清洁液洗时，汲取池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的的铭酸钾结晶会填坏汲取池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铝酸钾吸附于汲取池表面。紫外可见分光光度法检验操作程序编制部门：质量部编号：S0P-QC083-03页数：6/7每次测定时应采纳同一厂牌批号，混合匀称一批溶剂。（4）称量应按药典规定要求。配制测定溶剂时稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml.含量测定供试品应取2份.汲取系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内，作鉴别或检查可取样品1份。（5）供试品测试溶液的浓度，除各该品种项下已有注明者外，供试品溶液的汲取度以在0.3-0.7之间为宜，汲取度读数在此范围误差较小，并应结合所用仪器汲取度线性范围，配制合适的读数浓度。（6）用作晶型、异构体限制检查或含量测定，试样制备和详细测定方法均按各品种项下有关规定操作。4.2 红外分光光度法4.2.1 仪器及其校正，可使用傅里叶变换红外光谱仪或色散型红外分光光度计。用聚苯乙烯薄膜（厚度约为0.04mm）校正仪器，绘制其光谱，用3027cm"2851cm”、1601cm/、1028cm-1>907Cmj处的汲取峰对仪器的波数进行校正。在3000cm"区间允许相差±5cm"以内，在100Ocm1区间允许相差±1cm"以内。仪器的辨别率要求在3110-2850cm"范围内应能清楚的辨别出7个峰，2851Cm-I与2870Cm-I汲取带的辨别深度不小于18%透光率，1583Cm-I与1589Cm-I汲取带的辨别深度不小于12%透光率。仪器的标称辨别率，除另有规定外，应不低于2cm”。4.2.2试样的制备方法除另有规定外，用作鉴别时应依据药典委员会编订的药品红外光谱集第一卷（1995年版）与其次卷（2000年版）第三卷（2005年版）收载的光谱图所规定的制备方法制备。详细操作技术可参见药品红外光谱集的说明。4.2.3 正文中的各种项下规定“应与对比的图谱（光谱集XX图）全都。系指药品红外光谱集第一卷（1995年版）与其次卷（2000年版）第三卷（2005年版）紫外一可见分光光度法检验操作程序编制部门：质量部编号：S0P-QC083-03页数：7/7的图谱。4.2.4具有多晶现象的固体药品由于供测定的供试品晶型可能不同，导致绘制的谱图与药品红外光谱集所收载的光谱图不全都，遇此状况时，应按该药品光谱图中备注的方法进行预处理后再绘制比较。由于各种型号的仪器性能不同，试样制备时碾磨程度的差异或吸水程度不同等缘由，均会影响光谱的外形。因此，进行光谱比较时，应考虑各种因素可能造成的影响。附件：SOR-ZL103-01