部分电生理学的方法.ppt

第四部分 电生理学的方法,第一章 电生理常用主要仪器 一、阴极射线示波器 示波器是电生理学实验常用的显示设备，它具有频率响应高，显示直观的特点。根据光点暂留时间不同可将示波器分力长余辉、中余辉、短余辉示波器；根据示波管内电子枪的数目可将示波器分为单线示波器、双线示波器。根据生物电的特点，电生理实验室所用的示波器（oscillograph）应为高灵敏度、扫描速度慢（2s/cm-1s/cm）、频率在1MHz以下的。如用数字存贮示波器更好，它能把信号以数字形式存贮起来，随意调出，而且可以长时间显示在荧光屏上以利于分析和照像，它可以把信号数据直接送入通用计算机接口，也可以把存贮数据模拟输出，连接记录器和X-Y记录器描记出生物电位。有关示波器的结构与原理在学习生理学时已介绍此不再赘述。,二、生物电放大器 通常来自记录电极的生物信号很微弱，且混有大量的干扰信号，必须经生物电放大器放大去干扰后才能显示。一般放大器只有一个有效信号输入端，另一端参考电平接地，即所谓单端放大器；辨差放大器（或称差分放大器）有两个有效信号输入端，对异相信号（如生物电信号由一探查电极及一无关电极引导记录，这两个电极所获得的电位不同）进行放大，而对同相信号（如作用在两电极的交流电信号完全相同）则放大很少。生物电放大器都是用辨差放大器。这种放大器有二特点：零点漂移小，即输人电压为零时，输出电压应恒定的等于零。此在直流放大器尤为重要。能有效地抑制共模电压，放大器两个输入端所共有的电压，称为共模电压。好的放大器必须有很强的共模干扰抑制能力。此能力可用共模抑票然虮绮畋缺硎局 生物电放大器的性能好坏将直接影响实验结果的获取，对生物电放大器的基本要求是高输入阻抗（大于2M）、高共模抑制比（CMRR，大于100dB）、高增益（放大倍数大于10万倍）、高稳定性低漂移（小于10V）、合适的通频带（0100kHz）以及低噪声（小于3V）等。,1共模抑制比（CMRR）=Ad/AC，此比愈大愈好（一般为2万，最好达5万）。Ad为差模信号的增益（在双端输入的差动放大器中输入的幅值相同，极性相反的电信号，如生物电信号），Ac为共模信号的增益（在双端输入的差动放大器中输入的幅值相同，极性相同的电信号，如干扰信号）；CMRR越大表明放大器抗干扰能力越强。辨差放大器一般都有一平衡调节使电路两侧输出端电压在无信号时趋于零。这种放大器的两个输入端输入信号，是为双边输入，如一端与生物体接触不良或脱落成为单边输入，则共模抑制比降低而出现交流电干扰。2放大倍数（增益）前级放大器一般最大增益约1000-2000左右。配上示波器后级放大器，整个放大倍数应能达到5Ouvcm（记录脑电），如做肌电能达到10-20v/cm则更好。3噪音 输入短路无信号时，因放大器中元件内电子热骚动等因素使放大器仍有一定输出，此乃噪音。放大器的频带宽度愈大则噪音亦愈大。故频宽宜适当加以限制。由于噪音存在，故放大器的放大倍数不可能太大。在记录生物电信号时要注意信噪比，如噪音是最小信号的1/10则好。,4漂移 一般生物电放大器在接通电源后，经半小时应该稳定。交流放大器只有当时间常数超过一秒时，基线漂移才表现显著，漂移以小于10v小时，或小于10V/为好。5频率响应（通频带）放大器只能对一定频率范围内的信号进行均衡放大。超过这范围的信号，放大倍数就会降低，放大器对低频的放大能力下降至对中间频率放大能力的70时的信号频率称放大器的下限频率；放大器对高频的放大能力下降至对中间频率放大能力的70时的信号频率称上限频率。此两频率间所包括的频率为频带宽度，亦即频率响应或称通频带。放大器的通频带是指能被放大器放大的信号的频率范围，由于生物电信号的频率通常低于100kHz，因而生物电放大器的频带范围一般在0（DC，直流）-100kHz，可以通过调节放大器的时间常数和高频滤波来选择合适的通频带。6时间常数 交流放大器（阻容耦合放大器）其下限频率与所用交连的电容与电阻数值有关，也就是与时间常数有关（T=RC），时间常数也称为低频滤波。时间常数小则低频信号衰减大，故一定的时间常数就决定了电路的低频特性。一般放大器时间常数有0.01、0.1、0.3、1秒数挡。也就是说相当于频率为16，1.6，0.5，0.16Hz的低频滤波器。即在该频率处幅度减少30%低频响应f=1/（2时间常数），例如时间常数为0.3，f=1/（20.3）=0.5c/s。若时间常数选择为1秒，则频带低端的频率为0.16Hz，即只有大于0.16Hz的信号才能通过放大器。,7高频滤波 高频滤波指通频带高端的截止频率，将信号中较高频率部分滤掉，而保留其低频部分。如高频滤波选择了1kHz，则只有低于1kHz的信号才能通过放大器；通过选择不同的时间常数和高频滤波，可以得到合适的通频带，即保证被检测的生物电信号不失真通过的最小频带。8低频与高频滤波的运用 观察快速电波时，如肌电可用较小的时间常数使慢波滤掉，则基线平稳，而将高频滤波开至最大（即不要滤掉高频波）。当观察慢波时，则可用高频滤波以滤去快速电波如肌电，注意时间常数不能小，否则将引起失真。,频率范围 电压范围 时间常数 高频滤波 放大灵敏度心电 0.3-200c/s 60V-2mV 2秒 100c/s 0.5-1mV/cm脑电 0.5-70秒 30c/s或70c/s 50V/cm肌电 10-2000c/s 10mV-5mV 秒 不用 20V-1mV/c,三、微电极放大器 上述生物电前级放大器主要是用粗电极记录细胞外电流总和，即场电位。放大器输入阻抗相对较小一般在1-2M，放大器栅流一般为10-9A或更小些。但这种放大器不适用于作微电极实验。主要不同在于后者有一级阴极输出器（或称阴极跟随器，射极跟随器），其特点是：1放大器的输入阻抗很高，可达100KM；2放大器输入电容较小。微电极电阻很大，可与输入电容组成一时间常数很大的高频滤波器。使生物电高频成分受到衰减而严重失真。阴极跟随器输入电容可小至1-2pf；3微电极放大器输入极栅流小，普通放大器输入级的栅流太大，超过所检测细胞的兴奋阈值（10-8-10-9A）可刺激细胞而兴奋。同时由于栅流本身不稳定，微电极与细胞组织之间的外电阻也不很稳定。当栅流通过此电阻时会经常变动产生假信号，栅流应小于110-11A。,四、记录电极与刺激电极 1粗电极（包括电极板等）主要用于：引导心电、脑电、胃肠电、神经干动作电位等生物电；刺激外周神经、中枢核团以及肌肉等其他组织。材料：一般用金属制成，如银、铂、镍、不锈钢、钨等。用金属电极引导引导生物电位和刺激生物组织主要的干扰因素之一是电极的极化作用。当金属的电极放到生物组织上测量生物电时，电极与体液接触界面上就会产生一个电位差，此电位差将干扰生物电的测量，尤其是在引导记录频率缓慢而近于直流的生物电位时，更会使电位降低，造成引导的波形失真。在刺激时，当直流电通过组织，金属电极和组织之间发生了电解过程，它们产生了与刺激电流相反的电动势，此反电动势形成了极化电流，对抗了原来的刺激电流，使刺激电流的强度降低（失真）。在直流电接通的瞬间，即产生极化现象，刺激时间越长，极化现象越显著，刺激的实际电压就越低，造成失真现象越严重。,直流电刺激通过普通金属电极造成极化现象的原因是：阳极上积聚负电荷的阴离子，其结果为阳极被氧气充填，周围液体变酸性：2Cl-+H2O2HCl+（1/2）O2；阴极处聚集了带正电荷的阳离子，并在阴极处Na+与水的OH-离子相结合，其结果为阴极被氢气所充填，周围液体变成碱性：Na+H2ONaOH+（1/2）H2。为了消除极化现象，以便能精确地测定器官或组织在刺激与反应之间量的关系，以至不失真地引导器官或组织的自发和诱发电活动，就必须使用乏极化电极，乏极化电极具有对生物体体液相当稳定的电极电位，如Ag-AgCl电极，记录时在阳极上有Cl-离子聚集。此时阳极向电池供给电子e，而成Ag+离子，具体过程如下：Ag-eAg+，Ag+Cl-AgCl，在阴极上有Na+聚集，AgCl+eAg+Cl-，Cl-+Na+NaCl，这样在阴极处没有氧的薄层形成。在液体和金属之间的界面层实际上仍然被一层氯化银所覆盖，因而不产生极化电流。但AgCl电极释放Ag+对组织有一些毒性，最好要通过盐桥，如用外加浸有生理盐水的滤纸套或通过棉花与组织接触。常用的乏极化电极除了Ag-AgCl电极，还有Zn-ZnSO4电极、Hg-HgCl2电极。,2微电极 用粗电极记录中枢神经系统电位是群体细胞的综合电位，用微电极才能记录到单个细胞或单根纤维的电活动（细胞外记录，主要看频率，细胞内看波形与幅度）。局限的微量刺激也必须用微电极。常用的微电极有玻璃电极，金属电极（详见细胞外、内记录章节）。,五、电刺激的应用 电刺激在电生理实验中应用广泛，不仅在基础研究中而且在临床诸科（如神经科、五官科、心血管科）也常使用。电刺激的优点：1基本参数易于精确控制（如强度、时间、强度-时间变化率等）；2组织细胞的生理活动过程中往往都伴有电的变化，故符合生理状态；3电刺激强度不很大时，组织不易损伤组织可反复使用。电刺激波形大致有三种即:正弦波、方波，不对称的尖波（如电针仪输出的）。较常用的是方波，波形简单。易于产生和严格控制，计算刺激量也较容易，陡峭的前沿使刺激比较有效，但单向方波宽太大（超过1ms）或用直流电刺激长时可引起损毁效应。故应尽可能缩短刺激时间和强度。为了避免减少电解作用，可用双向方波，但反相的正波有时可产生阳极阻滞作用或阳极断电兴奋。正弦波对自主神经刺激效应强，几乎很少产生电解作用，每个波的时间周期随频率而改变。,(二）刺激电流强度 随各种实验而有很大不同。影响强度因素：1组织本身的兴奋性：A类神经纤维兴奋性高、刺激强度可很小。如以A的强度为1，B类为A的53.5倍，C类纤维为A类的100倍。2电流作用于组织的时间：刺激强度与电流作用时间成反比关系。3电流密度：电极粗细，被刺激组织离开电极的距离以及电极周围组织液的旁路等都会影响电流密度。用微电极刺激神经与肌肉细胞时，几个微安十几毫伏即足以引起兴奋。用粗电极刺激神经干所需约数伏。通过皮肤刺激需几十伏，几个毫安。通过浴槽中容积导体刺激离体肠肌标本其电压6080伏，电流要十几毫安，这是因为大部分电流经溶液旁路（刺激器输出电压需100V，最大输出电流20mA）。刺激强度可用刺激电极两端的电压或流经组织的电流量来表示。一般电流强度与电压强度是平行增减的。然而只有当组织电阻恒定时，电压才能反映电刺激的生理效应，实际上电刺激的效应取决于通过组织的电流量。,(三）电流作用时间（刺激波宽）确定波宽可根据：1被刺激组织动作电位锋电位的时程。2时值：Ams，B类或Cms，心肌0.5-2ms，平滑肌5-10ms，大脑皮层1-6ms，波宽太短所需电压高刺激效应弱，波宽太长产生电解，损坏组织。兴奋性高，时值短者，波宽可小，反之则大。（四）刺激频率 躯体神经约50-250Hz，内脏神经约2-5Hz，骨骼肌约10-150Hz，心肌及平滑肌0.1-1Hz，大脑皮层20-60Hz，中枢深部组织100Hz以内。各种频率作用于同一组织所起效应亦不一致，进行串刺激时应注意各串刺激彼此相隔时间应容许中枢兴奋或抑制状态消失后再予刺激。,六、电刺激器 刺激器按其输出方式可分为恒压刺激器和恒流刺激器。前者刺激量的大小是以电压表示的，一般用于对刺激定量要求不高或者在实验过程中实验对象的电阻抗变化不大的场合；后者刺激量的大小是以电流表示的，一般用于对刺激定量要求较高或实验过程中实验对象的电阻抗会明显改变的场合。一般常用的电刺激器产生方波。1刺激方式有：单次、连续、串刺激、双次刺激。2刺激参数：强度刺激脉冲的电压或电流幅度表示，波宽单个脉冲的宽度（时程）。3刺激频率（或周期）：是相对于连续刺激而言，实际上反映了单位时间刺激次数的多少。目前有两种表示方法：（1）用频率表示10Hz、100Hz等；（2）用周期来表示。两者的关系是：频率（f）=1/周期（T）。4同步脉冲 刺激器可输出一同步脉冲，它表示一次刺激的时间起点，同步脉冲送到整个实验系统中，使各仪器有共同的时间起点，因而保持了时间上的同步。同步脉冲送到示波器，触发一次光点扫描，也可送到另一台刺激器。,5时迟（延迟）是指从同步脉冲到刺激方波出现这段时间差；它使刺激方波或刺激引起的电反应出现的示波器荧光屏上合适的部位，以便观察，两个同步的刺激器可通过调节各自的时迟来改变它们先后次序和时间间隔。6占空系数 是指脉冲的宽度（d）与脉冲周期（p）之百分比，即d/p100，如占空系数为100%即成直流电。输出脉冲的宽度切不可大于或等于周期，脉冲宽度大于周期，频率会减慢，频率调节也失灵。在应用串刺激时，脉冲波宽应比串长的时距小得多，至少不应大于或等于串长的一半。占空比不超过50%，一般不会产生组织损伤。7刺激器的恒流与恒压输出 恒流输出指当组织阻抗（负载）增大或减小时，刺激器输出的电流变动很少。恒压输出指不论组织阻抗（负载）增大或减小，刺激器输出的电压变动很少。前者要求刺激器内阻很高，后者要求刺激内阻很低。这两者中以恒流更为重要，它表示通过组织的电流不变。组织对电刺激的反应大小与电流有关。,8刺激隔离器 这是刺激器的一个重要附件，使输出信号与地隔开，其作用是：（1）减小刺激伪迹，避免伪迹太大而使生物电无法辩识。（2）使刺激电流局限在刺激电极周围，刺激点可精确定位。（3）可以对组织同时进行多点刺激，而不致于引起相互干扰，切断了电流从公共地线传布的可能。（4）消除刺激中的直流成分，避免组织产生极化作用。目前普遍应用的是高频隔离器，简单的刺激隔离器可用铁芯变压器或低周变压器，但波宽大时，刺激波形失真。,七、减小刺激伪迹 刺激器输出和放大器输出具有公共接地线，使得一部分刺激电流入放大器的输入端，使记录器记录到一个刺激电流产生的波形，这不是生物电，而是刺激伪迹，伪迹产生的另一原因是刺激源与大地之间存在着电容和电阻，因而产生一电容电流，电流流过电阻，产生电压降而形成伪迹。伪迹的害处在于：1）其幅度可超过生物电；（2）有时使交流放大器产生“阻塞现象”；（3）伪迹之后还有一段时间不能恢复正常，干扰生物电记录。减小伪迹办法：（1）刺激电极与记录电极必须尽可能远离，但实际上常办不到，可在这两者之间接地。（2）应用刺激隔离器，或用Wagner接地法（在刺激隔离器输出两端并连一可变电阻，可变电阻当中头接地）进行调节。（3）在生物体上适当接地，甚至有时多点接地，通过移动接点的位置使刺激电流在容积导体中发生分布变化使记录电极的两点恰好在等电位面上。（4）旋转刺激电极或记录电极方向有时有效。,八、抗干扰与屏蔽 在电生理实验中任何干扰均导致信嗓比下降，输入信号减小，放大增益大时问题更突出，干扰分电干扰和机械干扰两种。电干扰包括电磁干扰、静电干扰、射频干扰、生物电干扰。（一）干扰来源 1电磁干扰 50周交流电干扰最为严重，交流干扰可通过电容，电感与电阻耦合而进入放大器产生交流信号。2静电干扰 可因不同物质作用相对运动引起电荷转移而产生，如在地毯上走动，甚至改变坐位资势。经常遇到的静电干扰是在信号中有慢的大幅度变化，这往往与受试者或实验者的运动有关。3射频干扰 生物电放大器属低频范围，对无线电、电视信号不敏感，但连接到动物身上的导线和电极可存在某些整流作用，这就会使放大器收到无线电载波的音频信号。4生物电干扰 如记录心电出现肌电干扰，记录脑电出现心电干扰。5机械干扰 动物呼吸、心跳以及周围环境、人员走动等震动引起的干扰，一般可用黄砂盆、防震橡皮、内胎、防震器防震等方法消除机械干扰。,（二）消除电干扰的方法原则是：1干扰源（交流马达，自耦变压器，磁饱和稳压器，日光灯镇流器，火花干扰源，电热设备，大功率电器）应远离记录系统，尽可能远离实验场所。2屏蔽与接地。3避免干扰的交流电信号形成环路，导线宜短而直，勿成线圈。（三）屏蔽 屏蔽常用来减少电容性干扰和磁性干扰。电容屏蔽常用铜或铝之类金属，对减少低频电容干扰很有效，但对减少射频干扰效果不大。铁屏蔽箱可屏蔽磁场，一个连续的屏蔽只应该一点接地，接地点一般选择在信号源端，屏蔽的接地线要阻抗小，如地线不良使干扰电压加大。（四）接地 自来水管或电源插座地线不宜作电生理实验室接地用，这种接地点到真正的地之间总有电阻存在，一些大马达外壳通过它接地则该接地点往往不处于真正的零电位，从而引入干扰信号，较好的接地线应该用铜质粗导线接连到埋于泥地的铜棒（埋入地下约1.5-2米深处）。所有实验仪器和设备均应通过此地线接地，仪器地线应短而粗，勿与电源线平行，勿中途打圈。接地原则是集中一点接地，不要串联起来接成环状。动物也应一点接地。,九、记录、贮存和分析电生理实验结果的仪器 电生理实验显示在荧光屏上的波形和图像，是研究工作所获的第一手资料，需要记录保存，留待分析。因此，就需要能真实地记录、科学地分析的系统加以处理。根据科学技术的发展过程，各实验室所使用的这类设备，有以下几种：1.示波器照像机 2.磁带录音机 3.生理记录仪 包括心电图机、脑电图机、肠胃电仪、多导生理记录仪等等，这类仪器都有放大与记录系统，可直接将一些生物电放大记录下来。但这类仪器都是用描记笔记录的，频率响应有限，不能用于直接记录单位放电等频率快的生物电信号。4.电子计算机与生物信号实时处理系统 微机（microcomputer）是电生理实验作忠实记录和精确分析实验结果以提高实验质量的有力工具。微机只能识别和处理数字量，所以需要把机体产生的生物信号的模拟量转换成数字量。这一转换过程称模数转换即A/D转换。这就是信号的采集过程，D/A转换则是实现数字量到模拟量的转换，以进行对储存信号的分析。根据实验的需要可以编制相应的计算机程序保证计算机在指令下运行。,第二章 细胞外、细胞内记录第一节 细胞外记录 细胞外记录（extracellular recording）是把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。由于活动部位的神经元产生去极化，未活动的部位处于正常极化状态，在容积导体中的两部位间电位不同，电流从一点流向另外一点。放置于细胞表面的电极就会记录出两者之间所产生的电位差。细胞外微电极记录的方便之处是电极不插入细胞。除了玻璃微电极外，金属微电极也是作细胞外记录的合适电极。细胞外所记录的电位比细胞内记录的小很多、这是由于信号受低电阻的细胞外液通路分流所致。在外周神经用细胞外记录，在发生兴奋的局部与临近部位间形成局部电流。因而可以记录到一个正-负-正的三相波。胞外电极记录的电位大小和波形会有多种变化。因此，对胞外记录电位的分析重点放在放电频率和潜伏期，而不去比较放电的幅度。,对电位分析的目的在于认清电位是从一个神经元的哪个部位产生的，便于判断实验结果的意义。如以电刺激视神经、在外侧膝状体的记录为例，可看到：突触前轴突的电位，是一个全或无的一个单向上升波。由突触后轴突所产生的也是单向上升波。但与突触前轴突电位有区别：（1）潜伏期ms；（2）对单一刺激常可引起多个电位；（3）上升波呈双凹形，形成M波。胞体电位为长时程负锋电位，其潜伏期与突触后轴突的电位相同；细胞外记录的树突电位为慢双向的全或无电位。起始为正波，它的潜伏期与突触后的相等，波形的慢变化反映冲动在树突的传导速度。比较由细胞各部位所记录电位的持续时间，轴突的最短约1ms，胞体较长为1.5-3ms，树突的最长为152Oms。总之，细胞外记录方法较易，但对其结果的解释较为复杂。,第二节 细胞内记录 细胞内记录(intracellular recording)记录膜电位须在膜的两侧各置一个电极形成一个环路，因此一个电极要插入细胞膜内。细胞内记录可以准确测量膜电位的绝对值。因为膜内到膜外的电阻很大，不可能出现短路的影响，故其值可以高达100mV以上。它还能测定兴奋性突触后电位（EPSP）。抑制性突触后电位（IPSP）及动作电位。细胞内记录法是研究神经元基本生物物理特性的有力手段。要成功而持久地记录细胞内放电，除具备必需的设备外，还有两件事要做好：1稳定问题，干扰稳定记录的活动来自两方面，即机械运动和由于动物呼吸和循环功能引起的运动。2使用合格的微电极，以免对细胞造成严重损伤。记录细胞内电位基本上多用玻璃微电极。,第三节 微电极 二、金属微电极制作 金属微电极具有电阻低、机械强度高、可直接穿透硬脑膜、电噪声低、可反复使用的优点，尤其是在慢性埋藏电极的实验中被广泛采用。同时它也是较理想的（微）刺激电极（尖端40-70m），但是制作过程比玻璃微电极复杂。钨丝金属微电极较为常用，钨丝有稳定的理化性质，并有强度大、韧性好的特点。用直径mm的细钨丝，拉直，剪成长100mm的小段，用沙纸打光。其中一端磨成锥形，锥形部分长约20-30mm，尖端约0.1mm，成为钨丝微电极粗坯。将粗坯的尖端长约20-30mm浸入己熔化的亚硝酸钠溶液内，快速拖过。注意要使电极尖端四周均匀地被腐蚀，蚀尖已达到要求的微电极依次在清水中清洗。制成的电极还需要向电极上涂绝缘漆进行绝缘处理，或者用硼矽玻璃管套入绝缘。已制成的金属微电极尚需检查表面是否光滑均匀及其绝缘性能。将电极接到4.5V电池的负极，正极与浸在生理盐水中的碳棒相接。当电极浸入盐水中时，只有在电极尖端有1-2个气泡。如尖端以外的部分出现成串气泡，则表示此电极不合格。,一、拉制和充灌玻璃微电极的方法 合格的微电极是记录细胞电位的重要条件。拉制玻璃微电极的第一步是把已经清洁处理的毛细玻璃管放在微电极拉制仪上拉制玻璃微电极。分为两次拉制，可拉出一对尖端大小相等的微玻管，尖端直径可达0.5m左右。即时放在显微镜下检查，看其形状和尖端开口，以及尖端直径是否符合要求。如果进行细胞内记录，为了顺利穿刺细胞并减小损伤，可把微电极尖端磨成斜尖，这样的尖端也不易被阻塞。实验时，需要向微电极充灌盐溶液以保证电极的导电性。电极插入细胞后，充灌液和细胞内液之间会发生扩散作用而影响细胞内的成分。一般用3molL KCI溶液作微电极的充灌液比较合适，因为K+和Cl-的扩散系数相同，并都带有单位电荷，也可以用2%的旁胺天蓝、0.5mol/L醋酸钠溶液（pH7.7）作为充灌液。它的优点是在记录电位后，通以阴极电流2-10A/min，可将旁胺天蓝泳出而标记出电极尖端位置。用测量电阻的办法检查微电极尖端直径。其他条件相同时，电阻愈大，表示电极尖端愈细。电阻过小（如1-2M以下）表示电极尖端可能折断；电阻过大（如20M以上）表示电极中电解液可能有气泡等。一般微电极电阻在5-20M是可用的。,三、多管微电极 多管微电极的制作与单管的基本相同。不同之处有以下几点：（1）相邻管壁要预先熔合；（2）拉细段：其原则与单管微电极的拉制相同，但其速度要慢，以保证玻管相互充分熔合，使管壁有一定厚度；（3）拔尖：拉制成的多管电极还要分别把每只侧管的顶端在小煤气灯上加热烧弯，使其成放射状，以免各管的充灌液相混或造成短路。作为细胞内记录的多管微电极的中心记录管头端要比其他管伸出20m左右。靠玻璃丝的毛细管作用，直接向微电极管内注射灌注液，能保证溶液的浓度。遇有气泡，用细丝从微电极粗的一端伸入触探之将其驱出。这样在实验过程中即时充灌电极十分方便，通过极性作用于离子化溶液，推出带电荷的粒子作用于所记录的放电神经元。一般先在中心管充以3mol/LKCI或4mol/L NaCl，阻值在10-40M即算合格，药管的电阻不超过120M为宜。而用置换法充灌多管微电极的结果并不理想。充灌好的微电极放置在使其尖端可浸入蒸馏水的容器内，放在4冰箱内保存2-3d。,多管微电极与微电泳 多管微电极与微电泳注射是目前研究中枢机能的重要方法也是研究中枢递质的必要手段。微电泳在19年先由Nastuk描述，这种方法是借助微电极，通以一定的电流将离子化的物质电泳到一个神经元或肌细胞。它可以越过血脑屏障直接将物质施加于预定部位，使药物作用局限在较小范围内，使用量也可以按通过电极的电流量大致估计。又可较精确地固定作用时间，因而有很大的优越性。,四、具有特种用途的其他类型微电极 除以上所述研究细胞电活动用的电极外，根据不同的研究目的，利用不同的技术，己有一些新型微电极应用于电生理学的研究中。如离子选择性电极，是在玻璃微电极的基础上，在电极尖端涂以特殊膜材料，可以测定细胞内外的有关离子浓度，一般要做成双管电极，其一作为参考电极，另一作为离子选择性电极。此外还有免疫微电极，其原理是将待测物质的抗体结合在微电极尖端的外表面，在记录电位时，神经末梢释放的肽类物质与电极表面的抗体结合，故可在记录电位的同时，还可精确测定肽的释放部位，上述各种微电极都是用于记录电位。微电极还可用作细胞内电刺激（详见胞内电刺激），也可用于细胞内标记技术。,第三章 脑内电刺激 脑内电刺激法是研究中枢功能定位的经典方法之一。脑内电刺激法不仅被广泛应用于动物实验，而且也被应用于临床治疗。但必须指出此方法也有缺点，例如电刺激对于神经元胞体、轴突或树突的兴奋作用没有选择性，刺激电流易于扩散超出所要兴奋的范围等。因此用电刺激方法得到的实验结果应结合其他方法所得结果仔细分析，下结论要慎重。一、刺激电极 刺激电极有单极和双极刺激电极之分。单极刺激电极可用不锈钢丝、康铜丝。银丝或针灸针制成。电极要直，尖端光滑呈圆锥状，电极要用绝缘漆进行绝缘处理，尖端裸露mm。双极刺激电极可由两个单极刺激电极并列而成。另一种双极刺激电极是同心圆电极。刺激电极在使用前，必须检查其绝缘性。其方法是把电极接在1.5V干电池的阴极，浸入生理盐水中。只有电极尖端裸露部分有气泡形成才符合要求。双极刺激电极在使用前常用万用表测量其在生理盐水中的电阻，一般在20-60k为宜。,二、刺激参数 用于观察脑内某些核团或脑区的生理机能时，采用长串方波，其波宽小于lms，常用0.4或0.2ms，强度小于200A，频率在100Hz以下。在研究某核团或脑区与另一核团或脑区的纤维联系时，采用单个或2-5个的短串方波。诱发顺行冲动，其他参数同上。三、刺激电极尖端定位 判定刺激电极的位置，一般用直流电凝固法。即将单极刺激电极接阳极，动物头皮接阴极，或同心圆电极外套接阳极，内芯接阴极，通以1mA左右，15-60s的直流电，然后将动物脑用10福尔马林液固定，切片进行组织学鉴定。,四、脑立体定位术 脑立体定位术是应用脑立体定位仪将电极插入脑内某一特定的区域或核团进行刺激、破坏或引导电位（也可用其进行微量注射），借以了解该部位的生理功能。这在神经生物学、神经药理学及神经病理学也获得广泛应用，在中医药的研究中也常使用。脑定位术的原理是根据前后、左右及上下三维座标来定位，参照动物颅骨的某些标志，如矢状缝、外耳道中心轴、前囱中心（Bregma）、人字缝尖（Lamda），上门齿根部等部位，这些标志与脑内某一结构有相对恒定的关系。通过参照有关脑立体定位图谱，便可寻找实验所需要的部位。,第六章 体表心电图 尽管心电图应用到临床己近百年，但至今仍是应用最普遍的心电活动的记录方法，也是发现和粗筛心律失常的最常用的方法。狭义的临床电生理的概念是指心内心电图及程序心脏刺激，但广义的概念包括体表心电图。除标准12导联心电图外，体表记录心电图技术还有如下多种：体表标准导联心电图；心向量图；食道心电图；动态长时程心电图；运动心电图；正交心电图；高频宽幅心电图；心室晚电位；体表希氏束电图。,第六章 体表心电图 尽管心电图应用到临床己近百年，但至今仍是应用最普遍的心电活动的记录方法，也是发现和粗筛心律失常的最常用的方法。狭义的临床电生理的概念是指心内心电图及程序心脏刺激，但广义的概念包括体表心电图。除标准12导联心电图外，体表记录心电图技术还有如下多种：体表标准导联心电图；心向量图；食道心电图；动态长时程心电图；运动心电图；正交心电图；高频宽幅心电图；心室晚电位；体表希氏束电图。,