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自噬相关蛋白BeclinKLC3的表达与BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中的关系及其临床意义郑俊杰1游振辉11-福建省立医院基本外科福建福州350001第一作者：郑俊杰，福建省立医院基本外科电话：e-mail：通讯作者：游振辉，福建省福州市东街134号，电话：，e-mail：【摘要】目的：探究甲状腺乳头状癌中自噬相关蛋白Beelin1、LC3的表达和BRAF基因突变的关系及临床意义。方法：免疫组化法检测89例甲状腺乳头状癌病理标本的BeclinELC3的表达情况，并检测BRAF基因突变情况，分析二者的关系。结果：L甲状腺癌组织中Beclinl阳性率为36.0%(32/89),显著低于癌旁组织中的66.3%(59/89)(X2=16.390,P<0.01)；LC3阳性率为25.8%(23/89),显著低于癌旁组织中的53.9%(48/89)(X2=14.644,PVOoD，差异具有统计学意义。2.乳头状甲状腺癌癌组织中Beclinl低表达与淋巴结转移有关(P<0.05)。3.Beclinl表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系(r=0.210,P<0.05)；LC3表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中同样呈正相关关系(r=0.222,P<0.05)；BeCIinl表达和LC3表达在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系(r=0.360,P<0.05)o结论：LBeCIinI和LC3在甲状腺乳头状癌中低表达。2.Bcclinl的低表达与淋巴结转移有关，提示自噬水平降低可能增强甲状腺乳头状癌的侵袭性。3.在甲状腺乳头状癌中BRAF基因突变可激活自噬。【关键词】自噬；Beclinl;LC3；甲状腺乳头状癌；BRAF基因TherelationshipbetweenBRAFgenemutationandExpressionofautophagyrelatedproteinBeclinlandLC3inpapillarythyroidcarcinomaanditsclinicalsignificanceAbstractObjective:ToinvestigatetherelationshipbetweenBRAFgenemutationandExpressionofautophagyrelatedproteinBeclinlandLC3inpapillarythyroidcarcinomaanditsclinicalsignificance.Methods:theexpressionofBeclinlandLC3wasdetectedin89casesofpapillarythyroidcarcinomabyimmunohistochemicalmethod.TheBRAFgenemutationwasdetectedandthecorrelationbetweenthemwasanalyzed.Results:1.thepositiveexpressionrateofBeclinl1inthyroidcarcinomawas36%(32/89),wassignificantlylowerthanthatintheadjacenttissues66.3%(59/89)(X2=16.390,P<0.01);thepositiveexpressionrateofLC3was25.8%(23/89),wassignificantlylowerthanthatintheadjacenttissues53.9%(48/89)(X2=14.644,P<0.01),thedifferenceswereStatistieallysignifican.2.LowexpressionofBeclinlinpapillarythyroidcarcinomaisassociatedwithlymphnodemetastasis(P<0.05).3.TherewasapositivecorrelationbetweenBeclinlexpressionandBRAFgenemutationinpapillarythyroidcarcinoma(r=0.210,P<0.05).TherewasapositivecorrelationbetweenLC3expressionandBRAFgenemutationinpapillarythyroidcarcinoma(r=0.222,P<0.05).TherewasapositivecorrelationbetweentheexpressionofBeclinlandLC3inpapillarythyroidcarcinoma（r=0.360,P<0.05）.Conclusion:1.BeclinlandLC3werefoundlowexpressioninpapillarythyroidcarcinoma.2.ThelowexpressionofBeclinlisassociatedwithlymphnodemetastasis,suggestingthatthedecreaseofautophagymayenhancetheinvasivenessofpapillarythyroidcarcinoma.3.BRAFgenemutationcanactivateautophagyinpapillarythyroidcarcinoma.Keywordsautophagy；Beclinl；LC3；papillarythyroidcarcinoma；BRAFgene甲状腺癌是近年来在全世界范围内发病率增长最快的恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的类型。1-4BRAF基因与甲状腺乳头状癌的关系密切。甲状腺乳头癌中BRAF基因突变率达29%-83%o2BRAF基因位于7号染色体，是编码细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶，影响丝裂原活化途径蛋白激酶（MAPK）的活化过程，BRAF基因突变激活的MAPK促进细胞增殖、抑制分化与凋亡，是甲状腺乳头状癌发生发展中的分子事件之一，促进肿瘤的侵袭性。其中点突变致催化中心附近的600密码子的级氨酸被谷氨酸替代的BRAFV600E基因突变最为常见。5-6自噬是溶酶体降解异常蛋白和受损或多余的细胞器的囊泡过程。自噬是细胞内环境稳定的重要作用，对癌症的发生、发展起着复杂的作用，通常在肿瘤发生的早期，细胞自噬呈抑制肿瘤的作用；当肿瘤形成后，细胞自噬又可促进肿瘤细胞的生长。7但BRAF基因突变与自噬水平在甲状腺乳头状癌中的关系目前研究不多，仍存在较多争议及不同的研究成果，本实验通过免疫组化检测自噬相关蛋白Beclinl和LC3表达情况代表自噬水平同时检测BRAFV600E基因突变情况，分析二者的关系，为甲状腺乳头状癌的发生机制、诊断治疗方面提供临床数据。材料与方法1 .一般资料：本研究收集并筛选出福建省立医院2016年1月-2016年3月间经规范手术治疗89例甲状腺乳头状癌的手术标本，所有病例均为初治病人，术前未接受甲状腺相关治疗。排除条件：病灶过小无法采集及未行BRAF基因检测，同时排除合并甲状腺其他类型的恶性肿瘤。以癌旁组织作对比，癌旁组织病变包括结节性甲状腺肿，桥本，弥漫性甲状腺肿大。其中男27例，女62例，45岁及以上53例，小于45岁36例，病灶直径大于ICm36例，小于等于ICm53例，单发48例，多发（包括双侧）41例,腺外侵犯59例，无腺外侵犯30例,淋巴结转移52例，无淋巴结转移37例，临床分期：ITI期53例，11HV期36例。2 .方法：主要试剂：本实验中所用一抗（兔抗人）均购自BioworldTechnology,Inc.l抗（酶标抗小鼠/兔IgG聚合物）及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。免疫组化（EIiViSiOnSUPer法）：首先，将标本切片在60条件下孵化IOinin,然后置于二甲苯中脱蜡30min,用浓度逐步降低的乙醇溶液继续脱蜡去水10min0用热修复法修复抗原以提高抗原的暴露程度后室温下用0.3%的H202抑制内源性的过氧化物酶活性Iomin。PBS冲洗后用一抗孵化1h,反应增强剂孵化20min后二抗孵化30min。用DAB显色在室温下显色5min,苏木精染色5min0阴性对照组为PBS液。BRAFV600E基因检测方法：提取DNA：操作步骤按照说明书进行。BRAF基因V600E突变的检测：操作按照说明书进行。3 .结果判断：染色强度评分：无色：O分，浅色：1分，棕黄色：2分，棕褐色：3分；阳性细胞所占百分比评分：每张切片选取5个高倍视野，分别计数每一视野中阳性细胞占总细胞数的百分比,其平均数为该阳性细胞百分比的结果,0-9%为0分,10%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%TO0%为4分。以染色强度与阳性细胞百分比乘积来评价蛋白的表达强度，本研究为方面统计，BeClinl表达(一)：0-3分；(+):大于4分；LC3阴性及低表达(一)：0-6分；高表达：大于6分。4 .统计学方法：采用SPSS22.0软件，各组之间的比较分析采用卡方检验。两变量之间相关关系的研究应用SPearmarl相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1. Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平及BRAF基因突变率：甲状腺癌组织中Beclinl阳性率为36.0%(32/89),显著低于癌旁组织中的66.3%(59/89)(X2=16.390,P<0.01)；LC3阳性率为25.8%(23/89),显著低于癌旁组织中的53.9%(48/89)(X2=14.644,PVO.01),差异具有统计学意义。表1：Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平BeclinlX2/P值LC3X2/P值(+)(一)(十)(一)癌组织325716.390<0.01236614.644<0.01癌旁组织59304841BRAF基因突变率87.6%(78/89)。在甲状腺肿瘤中，BRAF突变发生只有在甲状腺乳头状癌和一部分甲状腺未分化癌，未在甲状腺良性肿瘤、滤泡癌或髓样癌发现。2故本研究未对良性病变行BRAF基因突变检测。2. Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与临床病理参数关系：乳头状甲状腺癌癌组织中Beclinl阳性表达与年龄、性别、病灶大小、单发多发、腺外侵犯程度和临床分期无关无关(P>0.05),与淋巴结转移有关(P<0.05)OLC3的阳性表达与乳头状甲状腺癌的年龄、性别、病灶大小、单发多发、腺外侵犯程度、有无淋巴结转移和临床分期无关(P>005)O表2：Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与临床病理参数的关系临床病理参数nBeclinlX2/P值LC(+)X2/P值+-+-年龄<453612240.180/0.67111250.701/0.4032455320331241性别男2711160.385/0.5357200.000/0.991女6221411646病灶大小lcm5315383.333/0.06812410.701/0.403>lcm3617191125单发多发单发4819290.596/0.44010381.364/0.243多发4113281328腺外侵犯无3014162.255/0.13311192.767/0.096有5918411247淋巴转移无3718194.431/0.0359280.076/0.783有5214381438临床分期ITI期5322311.755/0.18515380.413/0.520InTV期3610268283.Beclinl和LC3表达情况与BRAF基因突变的关系:本研究对Beclinl和LC3表达与BRAF基因突变进行spearman相关分析发现：Beclinl表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系(r=0.210,P<0.05)；LC3表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中同样呈正相关关系(r=0.222,P<0.05)；BeClinl表达和LC3表达在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系(r=0.360,P<0.05)0表3：Beclinl和LC3阳性表达与BRAF基因突变的相关性BRAF基因突变Beclinlr值/P值LC3r值/P值(+)(一)(+)(一)阳性31470.210/0.23550.222/0.048037阴性110011表4：Beclinl和LC3的表达水平在甲状腺乳头状癌中相关性BeclinlLC3r值/P值+-+15170.360/0.01一849讨论自噬是一种依赖于溶酶体的降解途径，在细胞发育、免疫和应对各种应激中起着重要作用。自噬与各种肿瘤的发生发展密切相关。BeCIinl与LC3常常被用自噬水平的标志蛋白。BeCIirlI是酵母atg6/vps30基因在哺乳动物中的同源物,是一种肿瘤抑制蛋白，可通过结合BCI-2,与O类磷脂酰肌醇-3激酶形成调控复合物等多种途径自噬，LC3是酵母atg8基因在哺乳动物中的同源物，在自噬中参与泛素化修饰、形成自噬膜体等。7-8各种肿瘤的自噬水平各相同9,在甲状腺乳头状癌中自噬水平下降。ZhuH等10检测80例甲状腺癌及癌旁组织中ARHI和Beclinl蛋白的表达水平，甲状腺癌组织中ARHI和Beclinl蛋白水平明显低于对照组在邻近组织中。ZhangN等11同样发现LC3-II蛋白水平在甲状腺癌中的表达明显低于正常甲状腺组织。这与我们的实验结果相同。本研究结果发现甲状腺乳头状癌组织中自噬相关蛋白BeelinI与LC3的阳性率显著低于癌旁组织，这提示甲状腺乳头状癌中的自噬水平下降，说明自噬水平降低参与了甲状腺乳头状癌的发生。自噬同样参与肿瘤的发展及侵袭性改变。自噬在肿瘤发展的作用主要是一方面通过影响细胞代谢、细胞存活和细胞死亡，另一方面通过影响肿瘤微环境中的免疫反应。Beclin1表达增加与一些癌症的良好预后相关。12T4ZhuH等10同样发现在甲状腺癌中Beclinl蛋白低表达组的3年生存率明显低于高表达组。本研究发现BCClinI低表达与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移有关，侧面证实了Beclin1表达增加与良好预后相关。但仍见不同报道，如Li等15对86例PTC患者（57例有淋巴结转移）的标本进行免疫组织化学染色，发现88%的PTC组织标本和98%的转移淋巴结中Beclin1的表达增加，而在同一患者配对的正常甲状腺组织和无转移淋巴结中，Beclin1只是低表达或表达缺失。这说明自噬在肿瘤进展中的作用机制复杂，与肿瘤的分化程度、早期与晚期、肿瘤的其他因素（如BRAF基因突变状态）、肿瘤微环境等等可能均密切相关。自噬在肿瘤进展中的作用很大程度上取决于自噬与凋亡、衰老、免疫反应和炎症等其他基本生物学过程之间的相互作用。16BRAF基因突变可诱导细胞自噬在人恶性黑色素瘤的研究中被发现，BRAF激活的长非编码RNAS（BANCR）在人恶性黑色素瘤中过度表达并具有促进恶性黑色素瘤细胞转移的潜在功能，部分研究敲除BANCR可致恶性黑色素瘤细胞的88个基因发生变化，其中有几个基因与肿瘤的侵袭性有关。17-18部分研究提供了在大肠癌中BRAF基因突变诱导自噬主要标志蛋白如Beclinl和LC3。并指出其通过MEK/ERK信号通路起作用。19在甲状腺乳头状癌中BRAF基因可能通常BANCR激活自噬水平影响肿瘤的生物学行为，自噬在癌细胞中被激活并有助于肿瘤细胞存活率。18BRAF基因可通过ERK/TSC2/RHEB信号通路激活mTOR（mammaliantargetofrapamycin）哺乳动物雷帕霉素靶蛋白Cl激活自噬。此外，BRAF的活化促进了ERStreSS（内质网应激）触发自噬。20本研究非大样本数据，可能存在选择偏倚等不足，但仍提示自噬相关蛋白BeCIir11、LC3与BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系，表示在甲状腺乳头状癌中BRAF基因突变通过某些途径激活自噬。众多研究提示治疗诱导的自噬作为一种耐药机制发挥作用，所以抑制自噬活性的抗癌疗法可能是普遍适用的。21-22BRAF基因可激发自噬水平，可作为研发自噬依赖肿瘤的抑制剂的重要切点。23综上所述，自噬与BRAF基因均影响甲状腺乳头状癌的发生、发展，BRAF基因突变通过某些途径激活自噬，这对提高甲状腺乳头状癌的认识、诊断及寻找新的靶向治疗药物有重要的临床意义。参考文献：1 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