遗传的制作和基因定位上.ppt

第四章 遗传图的制作和基因定位,遗传学图（genetic map)又称基因连锁图（linkage map)或染色体图（chormosome map)，是一种依据基因之间的交换值（或重组值）表示基因在染色体上相对位置的简单线性示意图。,基因定位（gene mapping）：是指将基因定位于某一特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序与距离。,基因在染色体上各有其一定的位置 确定基因的位置主要是确定基因之间的距离和顺序 基因之间的距离是用交换值来表示的，叫图距，图距单位是厘摩（centimorgan，cM)。,准确地估算出交换值 确定基因在染色体上的相对位置 把基因标志在染色体上。,基因定位所采用的主要方法是两点测验和三点测验。,4.1真核生物基因定位的基本方和遗传图的制作,1两点测验:,先用三次杂交、再用三次测交(隐性纯合亲本)来分别测定两对基因间是否连锁，然后再根据其交换值确定它们在同一染色体上的位置。,测出Aa-Bb间重组率 确定AB是否连锁；,测出Bb-Cc间重组率 确定BC是否连锁；,测出Aa-Cc间重组率 确定AC是否连锁。,如果上述3次测验确认3对基因间都是连锁 根据交换值的大小 确定这三对基因在染色体上的位置。,例如:已知玉米子粒有色(C)对无色(c)为显性，饱满(Sh)对凹陷(sh)为显性，非糯性(Wx)对糯性(wx)为显性。,第一组试验：CCShSh ccshsh F1 CcShsh ccshsh,为了明确这三对基因是否连锁遗传，分别进行了以下三个试验:,第二组试验：wxwxShSh WxWxshsh F1 WxwxShsh wxwxshsh,第三组试验：WxWxCC wxwxcc F1 WxwxCcwxwxcc,第一组试验：CCShSh ccshsh F1 CcShsh ccshsh,4032 4035 149 152,交换值(149152)/(4032+4035+149+152)100%3.6%,第二组试验：wxwxShSh WxWxshsh F1 WxwxShshwxwxshsh,交换值(15311488)/(1531599158851488)100%20%,第三组试验：WxWxCC wxwxcc F1 WxwxCcwxwxcc,交换值(739717)/(25427397172716)100%22%,第一、二个试验结果表明，Cc和Shsh是连锁遗传的，Wxwx和Shsh是连锁遗传的。所以Cc和Wxwx肯定是连锁遗传的，根据这二个试验结果，这三对基因在同一染色体上的排列顺序有两种可能：,第三个试验结果表明，Wxwx和Cc两对基因在染色体上相距22个遗传单位。这与23.6个遗传单位接近。所以，可以确定第一种排列顺序符合实际。,这样就把这三对基因的相对位置初步确定下来。用同样的方法和步骤，还可以把第四对、第五对及其它各对基因的连锁关系和位置确定下来。,不过，如果两对连锁基因之间的距离超过5个遗传单位，两点测验法准确性就不高。,摩尔根和他的学生Sturtevant改进了上述二点测交，创造了新的测交法三点测交。,在两点测交中，对于双交换是无法检出的，因为在两个基因之间双交换的结果等于没交换。,2.三点测交（three-point testcross),三点测验:通过一次杂交和一次用隐性亲本测交，同时测定三对基因在染色体上的位置，是基因定位最常用的方法。优点：(1)纠正两点测验的缺点，使估算的交换值更为准确；(2)通过一次试验可同时确定三对连锁基因的位置。,(1)确定基因在染色体上的位置：以玉米Cc、Shsh和Wxwx三对基因为例：P 饱满、非糯、有色凹陷、糯性、无色+shsh wxwx cc F1 饱满、非糯、有色 凹陷、粒性、无色+sh+wx+c shsh wxwx ccFtF1配子及Ft表型见下表：,CCShSh ccshsh F1 CcShsh ccshsh FtC-Sh=(98+107+39+19)/6033=4.36%,先不考虑wx，只考虑C-Sh间的情况，这样就可以计算出C-Sh间的重组值,不考虑wx，只考虑Wx-Sh间的情况,可算出Wx-Sh间的交换值,wxwxShSh WxWxshsh F1 WxwxShsh wxwxshsh Ft Wx-Sh=(672+662+39+19)/6033=23.07%,WxWxCC wxwxcc F1 WxwxCcwxwxcc Ft C-Wx=(98+107+672+662)/6033=25.51%,按照同样的方法可算出Wx-Sh间的交换值,根据这三个数据可以将这三个基因作如下的排列,三点测交的一般方法 表型实得数 比例(%)重组发生位点 a-b a-c c-b a+580 80.9+b c 592 a b c 45 5.9+40 a b+89 12.6+c 94 a+c 3 0.6+b+5 合计 1448 100 18.5 6.5 13.2,ab=18.5 a c b c6.513.2 19.7 cM ab(a c b c)?应加双交换值 abaccb2（ac）（cb）18.5 0.626.5 13.2 19.7(cM)a c b 13.2cM 6.5 cM 图 acb的顺序和图距,a+c b a c b+a+b+c+a c+c,三点测交实验的意义在于:,（1）比两点测交方便、准确。一次三点测交相当于3次两 点测交实验所获得的结果；（2）能获得双交换的资料；（3）证实了基因在染色体上是 直线排列的。,3干涉(interference),在染色体上，每发生一次单交换时，它的邻近基因间也发生一次交换的机会就会减少，这种现象称为干涉。,根据概率理论，如单交换的发生是独立的，则双交换值=单交换值单交换值=0.23070.436100%=1.0%,实际双交换值只有0.15%，说明存在干涉。,并发系数=实际双交换值/理论双交换值=0.15/1.0=0.15 0，干扰严重。并发系数常变动于0 1 之间。,并发系数等于1时，无干扰，两个单交换独立发生；并发系数等于0时，表示完全干扰，即一点发生交换后其邻近一点就不交换。,表示干扰程度通常用并发系数表示：,4.连锁遗传图制作,通过连续多次二点或三点测验，可以确定位于同一染色体基因的位置和距离，把它们标志出来后可以绘成连锁遗传图。,连锁群：存在于同一染色体上的全部基因。,一种生物连锁群数目与染色体对数一致，可暂时少于染色体对数：如：水稻n=12、玉米n=10、大麦n=7连锁群数 12 10 7,绘制连锁遗传图：以最先端基因为0，依次向下，不断补充变动。位于最先端基因之外的新发现基因，则应把0点让给新基因，其余基因作相应变动。,图10-4果蝇的遗传学图(遗传连锁图),关于遗传图还需做以下说明：重组率在0%-50%之间，但在遗传图上，可以出现50个单位以上的图距。原因是这两个基因间发生多次交换的缘故。所以从图上数值知重组率只限临近的基因座之间。,4.2脉胞霉四分子及其遗传学分析,链孢霉（Neurospora crassa）的生活史：链孢霉Neurospora是真菌，属于子囊菌纲，在遗传研究上应用极广。这类真菌特别有利之处在于它们一方面行有性生殖，具有跟高等动植物行为相象的染色体，另一方面又象细菌那样有较短的生活周期。链孢霉的有性生殖周期只要10天，能在含碳源和某些无机盐的简单培养基中生长。,链孢霉(Neurospora crassa)是一种丝状真茵，生活史相当复杂(图6.2)。培养的链孢霉是由许多分枝的细丝即菌丝组成的，菌丝由隔壁分成隔，每隔有近百个单倍体核。它们的生殖方式通常是无性的，菌丝体发出气生菌丝，长出无性孢子，叫做分生孢子，有的是单核的小分生孢子，有的是多核的大分生孢子，分生孢子萌发出新的菌丝。,有性生殖只有在两个不同交配型菌株一起生长时才会进行。在固体琼脂上，两个菌株都形成许多雌性生殖结构，称为原子囊壳。原子囊壳是菌丝的圆形聚合物，包有特殊的菌丝，向空间伸展成为受精丝。不同交配型的小分生孢子(有时甚至一根菌丝体)与受精丝相接触时就发生受精作用。准备进行融合受精细胞的核移至受精丝下部，进入称为产囊体的特殊菌丝中去。这时细胞核的变化是很复杂的，实际上两种交配型的细胞核都进行分裂，成对的不同交配型的细胞核分到许多产囊菌丝中去。,接着在每条产囊菌丝中都发生下列过程：由每种交配型的一个核共同形成子囊原始细胞，这两个核在伸长的细胞中融合成二倍体细胞核；二倍体细胞核立即进行减数分裂；减数分裂的四个产物再进行有丝分裂，在一个子囊中形成四对子囊孢子。同时，其他菌丝形成了一个厚壁包围着产囊菌丝，构成长颈瓶状的子囊壳。,特别应当注意的是：每个子囊是一次减数分裂的产物，而每对孢子则是有丝分裂的产物，因此每对孢子的每个成员具有相同的基因型。每次减数分裂所产生的四个产物即四分体(四个分生孢子)不仅仍保留在一个子囊中，而且在子囊中成线状排列。这是一种有顺序的四分体(四分子或八分子在子囊中呈直线排列直列四分子，直列八分子，具有严格的顺序)，是提供遗传分析独一无二的非常重要的结构。,4.2.1四分子分析（tetrad analysis）和着丝粒作图,指根据一个子囊中四个按严格顺序直线排列的四分子(或其有丝分裂产物子囊孢子)表现进行的遗传分析，也称为直列四分子分析。链孢霉的特点是它的四分体是顺序排列的。不仅减数分裂的四个产物在子囊中仍连在一起，而且代表减数分裂四个染色单体的子囊孢子是直线排列的，排列的顺序跟减数分裂中期板上染色单体的定向相同。,四分体遗传分析的特殊意义在于：(1)能从四分体不同类型出现的相对频率计算连锁关系；(2)能计算标记基因与着丝点之间的连锁；(3)子囊中子囊孢子严格的交互性表明减数分裂是一个交互过程；(4)分析表明，每次交换仅涉及四个染色单体中的两个，而多次交换则可能涉及二价体的两个、三个以至所有四个染色单体。,让我们考察一下交配型不同的菌株的杂交结果。二倍体子囊原始细胞是Aa，经减数分裂产生两个A和两个a，再经有丝分裂产生四对子囊孢子。这四对子囊孢子在子囊中有六种排列顺序(表6.3)。为了方便起见，我们写出子囊孢子对的基因型而不写单个孢子的基因型。,表6.3 链孢霉的第一次和第二次分裂分离Lindegren(1932)关于交配型等位基因A和a分离的数据。他解剖了274个子囊并测定了每一孢子对的交配型。表中是六种可能子囊类型的数值。,表6.3中第1和第2种类型的子囊是第一次分裂分离的子囊，因为在第一次减数分裂时带有A基因的两条染色单体移向一极，而带有a基因的另外两条染色单体移向另一极，因此在每一子囊中两个A孢子对相互邻接，两个a孢子对也相互邻接。第3至第6种类型的子囊是第二次分裂分离的子囊，因为要到第二次减数分裂A和a才分离，子囊中相同的孢子对不相邻接。,A A A A A M A M A A a a A a a a a a a a(a)第一次分裂分离,A A A A A M a M a a A A a a A a a A a a(b)第二次分裂分离,第一次分裂分离:第二次分裂分离:图513 8个子囊孢子排列类型,*着丝粒作图(centromere mapping),如果减数分裂过程中，基因位点与着丝点间不发生非姊妹染色单体间交换，一对等位基因分离产生的两种类型的孢子将分别排列在子囊的两端；如果发生交换将产生不同的排列方式。可根据子囊中孢子排列方式判断该次减数分裂是否发生交换，并计算交换值；该交换值为基因与着丝点间的交换值，因此可估计基因位点与着丝点间遗传距离，并进行连锁作图，称着丝点作图。如果减数分裂的产物是随机分布的话，六种类型子囊的分布频率应该相同，而Lindegren得到的数据(表6.3)却清楚地表明并非如此。这是为什么呢？,在减数分裂时，带有A和a的同源染色体沿其长度配对，再分裂为染色单体并参与重组；如果二价体在中期板上定向和正常分离的话，在两个同源染色体之间至少应有一个交叉，倘若A位点与着丝点之间没有产生交换，两个等位基因A和两个等位基因a仍将附着在同一个着丝点上，并在第一次减数分裂的后期一起分离，减数分裂就只能产生第l或第2种类型的子囊。换句话说，第一次分裂分离时基因位点与着丝点之间并未发生交换。,当A位点与着丝点之间发生交换时，第一次减数分裂后，每个子细胞核得到一条具A和a染色单体的染色体。只有在第二次减数分裂中，每个染色单体分到各子囊孢子去的时候，A和a才相互分离。结果在子囊中，A或a孢子对，或a和A孢子对互相分开；每一个第二次分裂分离的 子囊是供试位点与着丝点之间发生一次交换的结果。,根据这种特殊情况，就有可能计算某一位点和着丝点之间的重组百分率。重组百分率的标准公式如下：,在第一次分裂分离的子囊中，Aa位点与着丝点之间没有重组的染色单体。在第二次分裂分离的子囊中，四条染色单体中有两条(即1/2)发生重组。在所有子囊中重组染色单体数是第二次分裂分离子囊数的2倍(2N2)。染色单体的总数是子囊数的4倍(4N1+4N2)，这里N1和N2是第一次和第二次分裂分离的子囊数。,因此，重组百分率是：这等于第二次分裂分离子囊数百分率的一半,根据Lindegren的数据，我们可以计算A位点和着丝点之间的重组百分率是：,4.2.2二对基因的四分子分析,现在我们考察一下涉及两对等位基因分离的杂交。,连锁分析,杂交：nic+ade其中 nic是菸酸依赖型，要在培养基中添加菸酸才能生长，ade是腺嘌呤依赖型，要在培养基中添加腺嘌呤才能生长。上面已讲过，一对基因杂交，有6种不同的子囊型，两对基因杂交，有6636种不同的子囊型；但是可把36种不同的子囊型归纳为7种基本子囊型。这7种子囊型和实得的子囊数列于表6.5,表4-3 nic+ade 杂交结果,分析方法相同，先算出nic位点和着丝点的重组百分率为：ade和着丝点的重组百分率为：,nic和ade之间有三种可能性可以考虑：第一，nic和ade可能位于不同的染色体上，并且是自由组合的。但第一种类型的子囊数大大超过预期，排除了这种可能性。第二，nic和ade可能在同一条染色体上，并位于着丝点的两边。这时它们之间的重组百分率大约应是14%。但是，nic和ade在同一条染色体上，并位于着丝点的同一侧。,第三，它们在同一条染色体臂上，重组百分率只有4.25%。如果nic和ade连锁，其重组百分率用重组孢子数总孢子数100的公式来计算。表6.5中，有208个重组孢子对，重组百分率为：,因此连锁顺序应该是：注意：9.30-5.05=4.25 5.2。这种差异我们在三点测验时也曾看到，这是因为某些二价体中存在一次以上重组的缘故（双交换）。染色单体干扰,六种子囊孢子排列方式,第一次分裂分离与第二次分裂分离,(1-2)两种排列方式：野生型lys+和突变型lys-在 AI 彼此分离，称第一次分裂分离(first division segregation)。着丝粒和lys基因位点间不发生非姊妹染色单体交换，因此这两种子囊类型就是非交换型子囊。(3-6)四种排列方式：第一分裂产物中野生型与突变型未发生分离，野生型和突变型 AII 发生分离，称第二次分裂分离(second division segregation)。着丝粒与基因位点间发生非姊妹染色单体交换，因此这四种子囊均为交换型子囊。,非交换型、交换型子囊的形成,将着丝点当作一个基因位点，计算基因位点与着丝点间的交换值，估计基因与着丝点间的遗传距离，叫着丝点距离。,4.3体细胞交换与基因定位,在正常情况下分裂分离和重组都是在减数分裂中发生的，但实验证据表明在有的有机体中交换也可发生在有丝分裂中，这叫做体细胞交换(somatic crossing over)或有丝分裂交换(mitotic crossing over)。,当a是纯合子的时候，b也是纯合子，但在有些克隆中，当b是纯合子的时候，a却不是，这说明a比b更靠近着丝粒。分析所有的克隆表型就会发现a是最近的，b次之，再着是c、d，最远的是e。某个体细胞克隆所出现的频率反映了某个有丝分裂交换所发生的频率，这个频率就可以用来计算有丝分裂图距。根据上面的例子，在a和b之间发生交换产生bcde的纯合子表型，因此a和b之间的重组值为6030020%，即ab之间的图距为20。,现假设观察到对a、b、c、d、e中任何一个基因是纯合子的个体300个，分布如下：,进行有丝分裂重组分析时需要构建杂合子。从构巢曲霉的两个不同品系开始构成异核体，然后再筛选出二倍体核。这两个品系在基本培养基上都不能生长，但异核体由于基因的互补是可以生长的。w和y两对等位基因都是控制无性孢子的颜色的，w导致产生白色孢子，y导致产生黄色孢子。,品系1：w ad+pro pab y+bio品系2：w+ad pro+pab+y bio+,用于曲霉实验中单倍体和二倍体的基因型与孢子颜色的关系,人类基因定位研究近来发展很快，在研究技术上主要应用体细胞杂交和DNA分析法。但是，对于那些无法以体外培养杂种细胞表达的性状或疾病，就需要借助于家系连锁分析法。这种方法适合于分析基因连锁、基因定位、基因诊断等。,4.4人类基因定位的基本方法,4.4.1 家系分析法,家系的连锁分析首先要从群体中选择适合的家系，要求被挑选家系中双亲之一或两个为双杂合体，并且注意双杂合体家系要随机抽样，避免产生偏倚。,同时必须剔除下列几种家系：（1）双亲性状不能在子代中得到分离的，如GgTtGGTT；（2）家庭中仅有一个子代的；（3）亲本之一的基因型不明或死亡的。,三代的系谱,在三代系谱中较容易确定子代是否发生基因重组，可直接计算重组值。例：如图，设黑色表示患一种显性的肌强直功能不全(mytonic dystrophy)；性状标志为唾液分泌类型，由Se和se一对等位基因所控制，Se为显性基因。,肌强直功能不全和唾液分泌类型发生分离的家庭,I-1个体患有肌强直功能不全症并伴有唾液分泌型的特性；I-2不患此病并为非分泌型。其生育的女儿（II-1）也为肌强直功能不全症并伴有唾液分泌型，所以她（II-1）的疾病和分泌型性状的两个基因来自父亲，说明疾病基因和Se基因在一条染色体上，她的基因型为GSe/gse，为相引相的双杂合体。第三代的性状开始分离，有的为分泌型伴疾病，有的不伴病。,在第三代六个子代中，III-1个体为健康者并为分泌型，说明原来疾病基因和Se基因连锁的染色体与其同源染色体间发生了交换，因此该个体为重组体。III-2 III-6均为非重组体。因此重组率为：1/6。,体细胞杂交法,体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。细胞杂交又称细胞融合（cell fusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybrid cell)，含有双亲不同的染色体。,杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。,由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号染色体上（表6.6）。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。,表6.6 杂种细胞系的染色体和TK活性 细胞系 人类染色体 TK活性（1）5，9，12，21（2）3，4，17，21（3）5，6，14，17，22（4）3，4，9，18，22（5）1，2，6，7，20（6）1，9，17，18，20,表4-5杂种细胞中标记基因的存在与人体染色体间的关系,4.4.3核酸杂交技术,4.4.3.1克隆基因定位法 用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA顺序进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色体的位置。,以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆基因定位法定位结果,4.4.3.2原位杂交法(in situ hybridization)是一种分子水平和染色体水平相结合、以标记了同位素、生物素或荧光染料的待定位基因的DNA序列或该基因转录产生的RNA分子为探针，直接同变性后的中期染色体进行原位杂交，探针同染色体DNA中与其互补的序列结合成双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定探针在染色体上的位置，达到基因定位的目的。,4.4.3.3原位PCR(in situ PCR),原位PCR是在单细胞或组织切片上对特异的核苷酸序列进行原位PCR扩增，再进行DNA分子原位杂交以进行细胞内基因(或特定DNA片段)的定位或检出的技术。,、固定细胞，尽量保存细胞固有的形态与结构。、蛋白酶消化：用胃蛋白酶、蛋白酶K等消化固定后的蛋白质交联网络屏障，使PCR反应试剂与靶DNA充分接触。、原位PCR扩增。、产物检测：直接法可用放射自显影、免疫组织化学或荧光检测等，间接法需用特异性标记探针进行引物杂交。,原位PCR的基本步骤是：,