遗传工程和转基因技术.ppt

DNA重组技术的应用,重组蛋白质的表达系统克隆能编码特定蛋白质的基因或cDNA.开发合适的表达系统,常用的表达系统,大肠杆菌E.coli 枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis酵母培养的昆虫细胞哺乳动物细胞 选择表达系统，根椐所生产的蛋白质的性状确定。,细菌细胞,优越性操作方便细菌繁殖快可获得大量蛋白质且价格低廉缺点多肽成份常不能适当的折叠，常形成不溶性包涵体。而从包涵体中制备的蛋白质常无生物活性。菌体因产生的大量异体蛋白，而对细菌产生毒性副作用，而使细菌培养物中细菌的浓度不高。细菌缺乏转录后修饰的酶，如在蛋白质上加上磷酸根，糖基。而这些修饰作用对蛋白质完成其功能常常是必须的。,酵母细胞,优越性为十分简单的真核细胞，其特性和哺乳动物细胞相似，而其生长和细菌一样快。可完成人类蛋白质的转录后修饰。并可诱导表达蛋白分泌至培养基中。缺点 其有活性的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白，使其产量降低。,昆虫细胞,利用昆虫病毒，杆状病毒在昆虫细胞中表达异体蛋白质。优越性1.蛋白能高水平表达，多肽能正确折叠。2.具有转录后修饰作用。缺点昆虫细胞培养价格高于细菌和酵母,哺乳动物细胞,生产哺乳动物蛋白质的最佳表达系统。启动子，载体，转染方法在哺乳动物细胞稳定组入扩增基因，可供产生大量蛋白缺点细胞培养价格高于细菌和酵母和昆虫细胞。,启动子 可使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备后面这几个条件1.它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达 量占细胞总蛋白的1030以上。2.这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平。,3.这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。如在大批量的蛋白质制备中，热和化学诱导便是两种广泛使用的方式。IPTG是杂种强启动子tac和trc的一种有效的化学诱导物。但对于人类临床药用蛋白质的大批量制备，IPTG则不是理想的诱导物，因为它有毒性。编码热敏感lac阻遏物的温度敏感突变体lacI基因，为诱导1ac及其派生启动子提供了方便的手段。,在启动子tac的一10和一35元件之间有一段17bp的间隔序列。核糖体结合位点,RBS 由ShineDalgarno,SD序列及其后的一段富含AT碱基的转译间隔区组成，间隔区的最适长度约为8个碱基。在转译起始期间，SD序列与16srRNA的3末端发生作用。三个起始密码子及其在大肠杆菌中的使用频率。三个终止密码子中其后连着U的UAA是大肠杆菌最有效的转译终止密码子。,调节基因R 编码阻遏物，可调节启动子的活性，它既可以存在于表达载体上，也可以是整合在寄主染色体上。转录终止子，TT 可使mRNA和载体分子稳定。抗菌素抗性基因，ter为载体提供了表型选择记号，复制起点，0ri决定着载体的拷贝数。,克隆载体,克隆质粒载体基因克隆的目的不仅是为了获得大量的克隆在载体上的DNA片段，而且还要考虑后续实验如测序，表达，突变的要求。,pGEM-T和pGEM-T Easy载体PCR扩增中常用的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶可以不需要模板在PCR产物上加一个A，一些生物公司根据这一特点研究制了T载体。在pGEM-T载体的两边还分别有一个限制性内切酶BstZ I的识别位点，如果在外源DNA片段上没有该酶的识别位点，只用该酶就可以将外源基因完整的切下来，根据酶切片段的大小对重组质粒进行签定。在pGEM-T Easy质粒的插入点两边，增加了EcoR I和Not I酶切位点，使外源DNA片段的鉴定更加容易。,表达质粒载体原核表达质粒载通常须具有一个强的启动子，一个位于启动子和起始密码子ATG之间的核糖体结合序列以及位于外源基因插入序列下游的转录终止序列。原核表达载体常用的启动子,lac启动子 较早使用的启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子，常用IPTG诱导，启动外源基因的表达。trp启动子 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，表达载体上的启动子常常包含操纵子的启动基因，操纵基因和部分trpE基因，删除了衰减子序列，在-吲哚丙氨酸的诱导下，转录水平比大肠杆菌中的正常启动子提高8到10倍。tac启动子 是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，但仍可以用IPTG诱导，tac是一个非常强的启动子，由tac启动子启动的基因的转录水平比lac和trp启动子高。,PL启动子 来自噬菌体，也是一个非常强的启动子。受噬菌体阻遏基因cI编码的阻遏蛋白的控制，表达载体的宿主菌带有一个cI基因温度敏感突变体，它表达的阻遏蛋白在2830才有活性，能够阻抑启动子的表达；当温度提高到42时，它的表达产物失去活性，启动子能够转录外源基因。这种温度诱导的特性是以PL为表达载体的一大优点。T7启动子 来自于T7噬菌体，有该启动子并在T7 RNA聚合酶驱动下表达外源基因的大肠杆菌质粒称为pET表达载体家族。T7噬菌体RNA聚合酶不仅能够选择性的与T7启动子结合，而且在不降低启动效率的前题下，其沿DNA模板合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5 倍，因此提高了对外源基因的转录水平。,pET表达系统表达外原蛋白必须使用特殊的大肠杆菌受体菌，如BL21和HNS174。这些菌株是噬菌体的溶源衍生菌，其染色体上含有PlacUV5启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因。pET表达系统是一个基因表达的级联反应，IPTG首先诱导 PlacUV5启动子表达T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶再选择性的结合T7启动子启动外源基因的转录。,pcDNA3.1/His表达载体 pCDNA3.1/His表达载体是Invitrogen公司的产品，载体采用人巨细胞病毒的立即早期启动子，用来在哺乳动物细胞内获得高表达的外源基因及进行基因功能的研究。pCDNA3.1/His载体是一种穿梭质粒表达载体，带有pUC质粒的复制起点和ampr基因，可以在大肠杆菌内扩增和选择重组转化子，同时载有SV40的复制起点和新霉素抗性基因，可以在表达SV40T抗原的细胞内复制并选择重组转化子。,表达载体起始密码子下游有一段编码6个组氨酸的DNA片段及编码一段短肽DLYDDDDK的DNA片段，外源基因克隆在这些基因的上游，构成融合基因。此融合基因能够表达目的蛋白和组氨酸，故通过标记组氨酸可分离纯化目的融合蛋白，组氨酸可以作为检测融合蛋白的标签。在表达载体上设计有蛋白酶的识别和切割位点，用蛋白酶可以切除融合蛋白上非目的蛋白的氨基因酸序列如组氨酸和DLYDDDDK短肽。,组织纤溶酶原激活物克隆表达,tPA 纤溶酶原纤溶酶水解纤维蛋白（可用于血凝块的溶解，治疗血栓梗塞性疾病）tPA基因（信号肽 和tPA CDNA）表达载体重组载体转染哺乳动物细胞用HAT培养基选择出稳定的转染细胞细胞表达低水平的tPAMtx（氨甲蝶呤）筛选细胞表达高水平的tPA细胞在发酵器培养tPA分泌tPA于培养液中。,DNA限制性内切酶消化,DNA限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤，内切酶是最关键的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA 的脱氧核糖核酸酶。酶单位规定为在最适应条件下小时完全消化1DNA的酶量为个单位。影响限制性内切酶活性的因素包括DNA的纯度、缓冲液、温度及酶本身。DNA甲基化，含有蛋白质或高分子量DNA胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5会抑制内切酶活性，因此在20l反应体系中，甘油浓度应少于1l。不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。缓冲液一般分为高、中、低盐种。一般使用厂家提供的与酶配套的缓冲液。,在需进行双酶切反应时，可采用以下不同的方法进行。如果两种酶的反应缓冲液相同或相近，可以同时加入两种酶进行酶切，但反应体积应稍大些，以免甘油浓度过高，影响酶的活性。如果相差甚远，则必须如下进行：在第个酶酶解反应完毕后，采用乙醇沉淀，回收已线性化的DNA，再建立第个酶切体系，继续酶解。也可先用低盐浓度的酶进行酶解，等酶解完全后，补加NaCl及相差的化学成分或调节pH然后再加入第种酶继续酶解。如果两个酶的反应条件只是温度上的差别，可以先加一种酶进行酶解，然后加入另一种酶在相应的温度下酶解。,酶解反应 主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是20l体积中含0.21gDNA。酶切反应体系如下 质粒DNA 10l 10缓冲液 2l 限制酶 1l 双蒸去离子水 7l 总体积 20l,操作方法 按下列顺序加入试剂(1)在一灭菌的新的Eppendorf管中加入7l双蒸水。(2)加入10缓冲液2l。(3)加限制酶1l(4)最后加入质粒DNA10l。(5)稍离心，混合。(6)37水浴12h。(7)取出后电泳分析鉴定是否酶解。,注意问题1.双蒸水为可变体积，当其它反应成分确定后，用双蒸水将反应体积 补足。2.为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的 冰浴中，操作应迅速，用后立即放回低温水箱中。3.大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。4.若要取用多种酶，每种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。5.大多数限制酶均加50甘油缓冲液置于-20保存，其活力稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确，小于总体积的1/10，否则甘油会抑制酶解反应。,UNIQ-10质粒提取试剂盒提取质粒DNA 本试剂盒的核心是UNIQ-10柱。柱的底部有一层由Sangon研制开发的惰性大分子材料，它能选择性吸附核酸物质，不吸附蛋白质，多糖和其它物质。DNA与UNIQ-1 0的结合需要一定的离子强度。抽提质粒时，细菌用常规的碱裂解，离心除去基因组D NA。含质粒的上清液加入到UNIQ-1 0拄中，经简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质。所要抽提的质粒用Elution Buffer，TE或者水洗脱。,质粒 DNA提取,操作步骤1 将过夜培养的12ml细菌12，000rpm离心15秒，彻 底去除上清。注意：对于低拷贝数的质粒，请用25ml细胞，同时按比例 相应提高Solution l，lI和llI的用量。在执行步骤5后，将 上清分批加入到UNlQ-10柱中，重复步骤6，直至处理完所有 样品。2.加入100 l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3加入200 l Solution II，立即温和混匀(倾斜45度角，顺一个方向，慢慢旋转离心管)，使细菌裂解，室温放 置2分钟。注意：不能剧烈混合，否则会出观基因组DNA污染。4加入350 l SoIution llI 立即上下颠倒510次，使之 充分中和，室温放置2分钟。5.12，000rpm，离心5分钟。,6将步骤5中上清转移到套放于2.0 ml收集管内的 UNIQ-10柱中，8，000rpm室温离心15秒。注意：不要吸取沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。7.弃收集管中的废液，将UNlQ-10柱放入同一支收集管 中，吸取500 l Wash Solution至 UNIQ-1O柱，10，000rpm室温离心30秒。8 重复步骤7。9 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管 中，1O，000rpm室温离心30秒以彻底去除Wash SOlutiOn。1 0将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5 ml离心管中，加 50l Elution Buffer，室温放置2分钟后，10,000rpm室温 离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。注意：如果要提高质粒的浓度，可以用30 l Elution Buffer,37或50下放置2分钟，10,000rpm室温离心1分钟。,DNA体外连接,利用DNA连接酶把目的DNA片段和载体DNA连接在一起，成为一个新的重组分子，这就是基因工程中常说的DNA体外连接。目的DNA片段被限制酶消化后其末端只可能有三种形式 1.带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。由于质粒载体也必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化，而且正反两种连接方向都有。为防止载体DNA自身环化，在连接前需除去载体分子5-p，使之最大限度地抑制载体环化现象。,2.带有非互补的粘端 用两种不同的限制酶进行消化可以产生这样的末端。一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶单酶切位点，用同样两种酶消化载体后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。3.带有平末端 由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶Klenow片段补平3凹陷，使不相匹配的末端转变为平端所致。,成功的连接反应需纯净的目的DNA片段，相对应的末端浓度。一般采用插入片段与载体DNA分子数比35:1。目的基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体，根据插入片段和载体的分子量大小、计算连接反应体系中需要加入的各DNA 片段含量。,粘性末端连接,碱性磷酸酶去除5磷酸基团 1.建立下列的反应系 线性化载体 10l 10CIP缓冲液 2l 碱性磷酸酶 CIP 0.5l 双蒸水 7.5l 2.37水浴15min 3.再加CIP 0.5l，置55水浴45min 4.加2l0.5mol/L EDTA,65灭活15min 5.乙醇沉淀，TE溶解。,载体与目的DNA片段的连接1.在0.5ml EP管中建立连接反应体系 线性化目的基因（0.4g）4 l 载体DNA（经CIP处理）1 l 10连接缓冲液 1 l T4DNA连接酶 1 l H2O 至 10 l2.16水浴12 6h。3.取2 5l连接产物进行琼脂糖凝胶电泳。,平粘端连接,1.制备目的基因酶切片段（如二端均为EcoRI粘端）。2.制备载体酶切片段（一端为EcoRI粘端，一端为其它酶切的粘端）。3.用T4连接酶连接匹配的粘末端（另一端不匹配，没有连接）。4.用Klenow补平不匹配的粘末端 目的DNA和/或线性载体 0.5g 10Klnow buffer 2l klenow片段 1l 2mmol/L dNTP 2l H2O 至20l 5.37水浴1h，乙醇沉淀，溶于7lTE（pH8.0）。6.取上述5lTE，加1l连接缓冲液，1l连接酶，ddH2O 13l作 用16 20h。7.电泳观察连接效果（2lTE 来自5,作连接前对照）并估计含量。8.取适量作转化。,重组DNA的转化,转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷变异株，即不含限性内切酶和甲基化酶。将对数生长期的细菌经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现遗传信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，可筛出带有异源DNA 分子的细胞。,试剂及仪器 1.LB液体培养基 2.LB固体培养基 液体培养基中加1.5琼脂糖 3.0.1mol/L CaCl2 4.抗菌素 5.培养箱 6.恒温摇床 7.无菌操作台,受体菌的培养 1.将甘油贮存受体菌EColi DH5在LB平板上划线37培养过液。2.从平板上挑取单菌落接种于1ml LB液体培养基中，37振摇过夜。3.取200300l菌液转入50ml LB液体中，37振荡培养2.53h 对数生长期 A600=0.30.5,感受态细胞的制备1.将培养的菌液冰上放置10min，倒入离心管内4000rpm10min。2.弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，控干。3.沉淀轻悬于10ml预冷的0.1mol/L CaCl2中，冰浴15min。此时为感受态细胞。4.4000rpm，4离心10min，弃上清，沉淀悬于2ml 0.1mol/L CaCl2中。5.分装成100l/小份于EP管中。贮存12-24h可增加转化效率，超 过24h效率下降。,转化加外源DNA 100500ng(小于5l)与100l感受态细胞混匀，冰浴30min（阴性对照同时进行）。2.将管转移到42水浴中加热冲击90秒或375min,迅速置冰浴冷 却3 5min。3.加400l LB，37轻摇培养45min（使抗性基因表达）。4.取100l涂布于筛选平板上（加抗菌素），对照菌涂布于另一筛选平板。5.室温至液体吸收后，37培养过夜。,重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子，重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。,重组质粒的筛选,插入失活法筛选 原理 该法选用于含有个以上选择标志的载体，如pBR322 带有氨卞青霉素 和四环素抗性基因。若将外源基因插入tet基因区后，则该基因失活，所构建的重组质粒转化菌落只能在Ap存在下生长，而不能在tet存在下 生长。据此，判断含有重组质粒的菌落。操作 1.制备LB琼脂培养板分别含有Ap和tet。2.将100l转化菌液用无菌玻璃涂布器分别均匀涂布于含Ap培养板 表面，置37培养箱20min后倒置培养1216h。3.挑取转化菌落并分别接种于Ap培养板和tet 培养板的互相对应的 位置上，37培养1216h。4.挑选在Ap培养板生长而在tet 培养板不能生长的菌落，并将其接 种于含Ap的LB液体培养基5ml中培养812h。5.小量制备质粒，限制酶切分析进一步鉴定。,互补筛选 适用于含有半乳糖苷酶基因，LacZ的载体，如pUC系列等，其原理是载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码半乳糖苷酶端部分序列的宿主细胞后，它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫互补。由互补而产生的Lac+细菌在呈色底物5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷，X-gal和诱导剂异丙基硫代-D-半乳糖苷，IPTG存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，可确定这些质粒的结构。,试剂X-gal(20mg/ml)将20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20避光存。IPTG(200mg/ml)将1gIPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml,0.22m过滤器除菌，-20 保存备用。操作 1.制备含氨苄青霉素的琼脂糖平板。2.于平板表面加X-gal 40l和IPTG 4l，并用无菌玻璃涂布器将试剂 均匀涂布于整个平板表面。置37 1h直至所有液体消失。3.将100l转化的菌液涂布于平板表面，置37培养箱20min后，倒置平 板继续培养1216h。4.中止培养后，将平板置44h，使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白 色两种菌落。5.挑取白色菌落置5ml LB(含相应抗生素Ap)液体培养基中，37摇床培养 812h，提取质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。,脂质体介导的转染,脂质体 一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔，它作载体可以把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。用超声波处理法，已成功地把带有内酰胺酶基因的重组质粒DNA装入带正电荷的脂质体。这些脂质体载体同培养的动物细胞一道温育后，在细胞的提取物中，便可测定到内酰胺酶的活性。带HSV-1 tk基因的重组质粒DNA，经脂质体包装后，成功地导入小鼠Ltk-细胞。这种由脂质体介导的使外源DNA导入细胞的方法，叫做脂质体载体法，又叫做脂质转染法。,本方法适用于将DNA或RNA转染进入组织培养细胞。其机制为阳离子脂质，如DOTMA,N-1-(2,3-二油酰氧)丙基 N,N,N-三甲铵硫酸二甲脂和DOPE,二油酰磷脂酰乙胺在与核酸混合后可以形成阳离子脂质体从而将核酸包裹于其中的水相。这种脂质体-核酸复合物可以吸附于细胞膜并将核酸转移到细胞内。这一转染方法比磷酸钙法相比，其转染效率要高5到100倍。它应用于将DNA或RNA分子引入真核细胞。,脂质体载体法 阳离子型的脂质体具有十分重要的作用。因为它不仅能够同带负电荷的DNA分子结合，也能够同表面为负电荷的受体细胞发生强烈的结合作用，而且还会引起细胞紊乱，导致脂质体与细胞膜之间发生融合作用，最终使DNA脂质复合物进入细胞。存在于细胞质中的DNA脂质复合物，仍然保持着完好的结构，并有机会以同样的方式与细胞核膜发生相互作用，并进入核内。,DNA脂质复合物转染法 将外源DNA与阳离子型的脂质体混合形成DNA脂质复合物。这种复合物可有效地被受体细胞捕获，实现基因的高频率转移，这种方法为DNA脂质复合物转染法。在这个过程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起的。,操作方法1.在转染之前，将细胞接种于60mm15mm培养皿上，培养24小 时。2.用MEM培养基洗涤单层细胞一次。3.在5ml聚丙乙烯试管中加入下列试剂 1.5 ml无血清的MEM培养基 50 l Lipofectin，1mg/ml GIBCO BRL产品 在另一只聚丙乙烯试管中加入 1.5 ml 无血清的MEM培养基 50 l DNA或RNA 519g 在加入每一项后混匀。4.吸去培养皿中的培养基。5.将两只试管内的溶液合并，并用移液管抽吸混匀。,6.将上述液体小心吸取3 ml转移至培养皿上，注意不要破坏细胞层。7.在37将细胞培养过夜。8.次日早晨，吸去旧培养基，并加入含20%小牛血清的MEM培养基。9.继续培养4872小时，而后收集细胞用于抽提及下步实验。,注意问题目前许多分子生物学公司均生产不同的产品用于阳离子脂质体介导的转染。如GIBCO BRL公司的Lipofectin和Boehringer Mannheim 公司的DOTAP。不必用无血清培养基洗涤细胞。在配制脂质体核酸混合液时必须使用无血清的培养基。因为血清可以抑制核酸与脂质体之间的相互作用。为了取得最佳转染效果，对于Lipofectin的用量，核酸用量以及细胞与Lipofectin和核酸复合物共同保温时间的最佳长度等问题，都必须根据不同的细胞株而决定。,TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。TA克隆是一种一步到位的把PCR产物直接插入到质粒载体的方法。TA克隆系统利用热稳定的TaqDNA聚合酶在DNA双链分子的3末端加上一个腺苷酸。这个3A突出端被用于把PCR产物直接插入到有一个3T突出端的载体。制备好的载体，其关键部分是带有3T突出端的线形分子。,PCR产物的TA克隆,PCR扩增 PCR产物在任何情况下都可用于TA克隆，但是带有3至5外切酶活性的聚合酶应尽量不用，这是因为克隆的效率极低。除非PCR产物是多种系的，否则一般没有必要纯化PCR产物。,连接ddH2O 5l10连接缓冲液 1l PCR载体 2l PCR产物 1lT4DNA连接酶 1l12保温412小时。,转化在冰上融化0.5mol/L 巯基乙醇和一小管感受态细胞，体积约 为100l。加2l0.5 mol/L 巯基乙醇于细胞中并轻轻敲打使之混合。加1l连接混合物于细胞中，轻轻敲打。冰浴30分钟。42保温30秒，并把小管置于冰上2分钟。加450l预热的SOC培养基于小管中，225rpm/min37振荡培 养1小时。铺25lX-Gal（40 mg/ml,溶于DMSO中）和5lIPTG(200mg/ml)于LB平 板之上，并等30分钟。铺25l和100l转化混合物于分离平板上。37倒置培养2040小时。挑选白色的菌落进行质粒电泳分析和限制性酶切分析，PCR扩增 以及测序。蓝色菌落是无插入片段的载体。,PCR产物的鉴别 PCR载体大小为3.0kb。克隆区含有许多限制性酶切位点。载体也 包含有M13正向引物和反向引物位点。所以用于PCR扩增的引物及用于这种载体的引物都能应用于测序和PCR鉴别。从筛选出的克隆中提取质粒，然后用下面的方法来区分插入片段是否为PCR产物。限制性内切酶切分析。Hind III 和EcoR I对载体的酶切可以释放 PCR 产物片段。PCR产物片段也可以用其它限制性内切酶酶切 分析。带有PCR引物的重组载体的PCR扩增应能产生同样大小的产物。用于载体的引物和应用于PCR扩增的引物都能对插入片段进行测序 分析。,转基因动物,把外源基因导入动物的受精卵，再将这一受精卵接种到寄养雌性动物，foster mother的子宫内，使之发育繁殖。这时外源基因与动物本身的基因整合，外源基因就能随细胞分裂而增殖，在体内得到表达，并能传给下一代。这样培育的动物称为转基因动物。最早完成的是转基因小鼠。,雌性鼠（卵）雄性鼠（精子）受精卵从输卵管洗出用显微注射法在前核内注入感兴趣的异体DNA把卵细胞移植于借腹怀孕的雌性小鼠雌性小鼠产生多胎新生小鼠DNA分析鉴定转基因小鼠显微注射法 将克隆的异体基因注入受精卵,受精卵 2个前核，Pronucleu,一个来自精子，一个来自卵细胞。2Pl体积的溶液（含几百个拷贝），直接注入一个前核内。受精卵移入寄养雌性动物的输卵管内子宫内着床 发育成熟转基因小鼠，transgenic mice携带异种DNA的小鼠转基因 transgene异种DNA,转基因家兔，猪，羊转入的基因是生长激素（hGH）观察方法检测hGHmRNA在转基因动物中的表达并 可测量hGH的产生。转基因动物本身的增大来观察hGH是否表达。成功率低 2000个注射卵，只有一个卵产生转基因动物。转基因牛 1000个受精卵，129个发育成胚胎，产生19个牛 仔，2头含组入基因组中的异体DNA。,