转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达.ppt

转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达,制片：何颖 舒冬梅 王惜 韩可以,操作目的：,采用RT-PCR技术，从黑曲霉的菌丝体RNA中扩散出葡萄糖淀粉酶GAT的结构基因，将其转接到pPIC9载体中，转入巴斯德毕赤酵母GS115中，获得重组酵母，使重组酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。,基因载体：pPIC9,操作方法：1.引物设计，根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表达载体，pPIC9的克隆位点，利用DNAsis设计一对扩增葡萄糖淀粉酶一基因的引物，上游引物为5-TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT-3,带有SnaB一位点；下游引物为5-GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG-3,带有Not一位点。,RT-PCR扩增：,首先，黑曲霉保藏菌种经查氏斜面培养基活化后，接种于100ml灭菌的黑曲霉液体发酵培养基中，加少量玻璃珠，200r/min、30，培养6670h,以其为实验材料,利用总RNA提取试剂合提取黑霉的总RNA。再用RNA为模板，以下游引物进行反转录，获得cDNA第一条链。65热变性5min，冰浴，然后加入反转录酶，置于PCR仪中，3010min，421h，942min。,再以反转录产物为底物，PCR扩增目的基 因，反应条件为943min热变性；9430s，5450s，722min，40个循环；,72延伸10min。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶试剂盒回收大约1.9kb的片段。将回收产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5a感受态菌，利用互补法进行阳性克隆的初步筛选。,表达载体的构建:,筛选重组子的示意图,C 转化子的筛选和鉴定（检）,基因工程的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,