质粒种类与应用.ppt

克隆载体,基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等,基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。,基因载体应具备的条件：（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3）有一定容量；（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体的功能及特征,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,质粒(plasmid),Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。Plasmid chromosome,质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并,被稳定遗传的一类核酸分子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，,即cccDNA,质粒DNA的分子量范围：1-300 kb,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝 stringent plasmid,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,质粒,质粒的基本特征,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定,20060421,质粒,质粒的基本特征,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,质粒,质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,质粒,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,发展概况,pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。,pBR322,有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,pUC质粒系列,pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。lacZ之内是M13的多功能连接器。,三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,pKO系列,组成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位点包括terr，.表达产物催化 Gal+ATP Gal-1-P+ADP以14C标记的半乳糖作底物,检测生成的*Gal-1-P的放射性。,在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算启动子功能的强弱。如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物,蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）,Z Y X,P,O,Z Y X,P,O,乳糖,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 C端序列,LacZ酶,基因克隆时的定向插入,插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿53方向正确转录，这种构建方式称为定向插入。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,APR,pUC19,质粒,质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒,质粒DNA的分离纯化,碱溶法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,质粒,质粒DNA的分离纯化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工,程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性：生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于裂解状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶原状态,噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 531bp，含50多个基因。,噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分,左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列。右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。,噬菌体基因大致分为4个区：结构区A J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和N、CI基因，O-R 为裂解区.,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,噬菌体及其组件的应用,噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用载体；不少先进的质粒应用组件进行构建。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体（置换型载体）,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1-2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一,些单一的酶切位点,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶,位点,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因灭,活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon2、Charon6、lgt11,取代型载体,lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40,正选择型载体,lEMBL1、lL47、l1059,野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），,这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外,源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌,体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,DNA的体外包装 是提高噬菌体转染效率的有效方法 在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性：生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。,M13 噬菌体的基因组为单链 DNA，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为 V00604）。基因组 90%以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因，和），形态发生蛋白（基因，和），结构蛋白（基因、和）。基因组 DNA 为正链，按基因 至基因 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。,M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm，直径 6-7nm。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因 编码的结构蛋白呈管状排列而成，成熟的基因 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的 螺旋蛋白。顶端由 5 个基因 和 5 个基因 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。5 个基因 蛋白和 5 个基因 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。右图是 M13 噬菌体结构模型。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性：感染周期,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,-DNA,II,V,在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA（replicative form DNA），即 RF DNA。通过 复制方式，RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。,单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的构建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混,浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊,斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,噬菌体或病毒DNA,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,考斯质粒与噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和,1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA,的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，,就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序,列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时,又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这,便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒,和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内,不能形成噬菌体颗粒。,粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。cos 序列是 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为31-45 kb,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体有多克隆位点、-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有 pBluescriptKS（），这类质粒一般由 4 个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端 Kpn 和 Sac 的顺序，用 KS 或 SK 表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA，用+或-表示）。pBluescriptKS（）的多克隆位点与 pUC18/19 的不同，且使用 f1 噬菌体的复制与包装信号序列。,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,人造染色体载体,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,F 质粒,大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。,细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS（Shizuya et al.1992），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和 parC）。BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。,20060424,真核生物载体,电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。,显微注射技术将外源DNA注入细胞,基因枪技术,是一种将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。PDS-1000/H台式基因枪可以实现对细胞的原位转导；应用于包括培养细胞、组织、器官、植物、动物、细菌和细胞器官等各种不同的目标。,穿梭载体（Shuttle vector）,是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。,酵母附加型质粒,2um质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1,REP2。2um质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。,以2um质粒为基础的载体酵母附加质粒,来自于2um质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。YEps可以含有完整的2um质粒，也可以只含有2um质粒的复制起点，如YEp13以后的类型。YEp13是一个穿梭质粒，含有2um质粒的复制起点和选择基因LEU2,YEp13还包含pBR322的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。,YEp的结构,YEp整合到酵母染色体上,根癌农杆菌Ti质粒,几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumorinducing）质粒介导的。,农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链TDNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。TDNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。,Ti质粒大约在160240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。,T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。,植物细胞转化的共整合系统,T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。,植物细胞转化的双元系统,目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。,典型的杆状病毒表达系统,典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。这些过程要求大量的操作时间，周期长达几周。BaculoDirect 杆状病毒表达系统简化了这些过程，节省了大量时间，使你可以比以往任何时候更快地获得杆状病毒表达结果。,BaculoDirect系统利用快速、简便的Gateway技术。BaculoDirect线性DNA包含了attR位点，允许与包含有目的基因的Gateway入门克隆进行有效的重组。将entry克隆、BaculoDirect线性DNA和Gateway LR Clonase酶混合物稍加混匀，在室温下反应1小时即可。最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（sf9或sf21）。,SV40病毒作为载体,反转录病毒,反转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序列(5LTR和3LTR)，有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列+，同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和env。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10