负染技术、扫描电镜样品制备技术.ppt

负染技术 阴性反差染色，染色剂不被样品吸收而是沉淀到样品四周。用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞成份的检测。（一）染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小2-4%磷钨酸，；2-3%醋酸铀，pH4.2,（二）操作方法 待检生物组织悬液滴于载网，静置5-10 min 用滤纸吸去载网边缘多余液体 载网未完全干 滴染色液，染色3-5min用滤纸吸去载网边缘多余液体，自然干燥，镜检,(三)影响因素 1.被检样品纯度和浓度 2.染色液pH 3.操作技巧,扫描电镜生物样品制备技术 含水量少的组织(骨骼、牙齿、毛发等)预处理、导电 含水量多的组织(大多数组织)预处理、干燥、导电一 样品预处理(一)常规样品 1.取材 58 mm，保护观察面 2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗，快！3.固定、脱水 同超薄切片,(二)游离细胞 收集所需细胞 适量0.1%多聚赖氨酸 PBS洗涤，1000rpm 5min,弃上清 46 mm玻片,室温5-10min 滴入2-4ml 0.5%戊二醛，4oC 0.5h 吸去多余液体,成膜 PBS洗涤，1000 rpm 5min,弃上清，制成悬液 细胞悬液滴于玻片，5-30min滤纸吸去多余液体 1%戊二醛，4oC 1h PBS漂洗，1%OsO4，4oC 1h，梯度酒精脱水,膜未干,（三）欲看剖面的结构实质性脏器的断面或细胞内部 用“割断法”暴露观察部位 1.常用的割断法 二甲基亚砜(DMSO)割断法 环氧树脂割断法 2.冷冻割断的操作 TF-1冷冻割断仪 简易割断器 注入液氮 固化包埋 割断 溶化冲洗,3.标本制作法取材(115mm)、前固定(1%OsO4，4oC 1h)浸洗(0.1M PBS，10min3次)DMSO浸泡(12.5%、25%、50%各30min)冷冻割断 后固定(0。1%OsO4，4oC 30min)双蒸水洗涤30min，2%单宁酸15min2次，双蒸水洗涤30min 1%OsO4，4oC 30min，双蒸水洗涤30min梯度酒精脱水,二 生物样品的干燥除去脱水剂使组织真正干燥，克服表面张力的影响，保存样品表面微细结构1.自然干燥法 无法避免表面张力的影响，仅用于含水较少的样品2.冷冻干燥法 样品以液氮快速冷冻 移至真空 冰升华为汽 费时 低温损伤,3.坎烯干燥法 升华介质坎烯 45oC以下为固态，室温中可升华 标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min 纯坎烯45oC 20min 室温，坎烯变为固体，放入真空、升华 4.乙腈干燥法 标本预处理 50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min(用乙醇配制)立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华,5.临界点干燥法 干燥效果最好，应用最广泛 原理 物质三相(固、液、气)相互转化，可单相存在，也可复相存在。临界状态：物质在特定温度(临界温度)时，表面张力系数为零，物质不以液态存在，变成气体。液态CO2临界温度：31.5oC，临界压力72.8kg/cm2,样品固定、脱水 中间液(醋酸异戊酯)置换 样品置入预冷的样品室 注入液态CO2 CO2置换 临界处理 放气取样,方法,三 生物样品的导电(一)目的 避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响(二)方法 1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面(100-200)金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率(100)；熔点低、易蒸发；机械稳定性能好；是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金,2.离子溅射法/离子镀膜法,优点：热辐射小 颗粒细、喷溅均匀 金属消耗少3.导电染色法/组织导电技术(TOT)利用金属盐(碘化甲、单宁酸)对生物体蛋白质、脂肪的结合作用,扫描电镜生物样品制备的基本程序,