蛋白质相互作用研究方法.ppt
蛋白质相互作用研究方法在植物中的应用及分析,农学院 王涛,Contents,摘要,引言,正文,总结与展望,4,1,2,3,摘 要,植物中的各种生理活动主要是通过细胞中的蛋白质进行控制和调节的。蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。通过研究蛋白质-蛋白质的相互作用,能够更好地揭示蛋白质功能,解码生命现象。因此，探究植物中蛋白质-蛋白质相互作用研究方法，具有十分重要的意义，也是目前蛋白质研究领域的热点。本文介绍了几种蛋白质相互作用的体内（in vivo）、体外（in vitro）及生物信息学（in silico）研究方法，分析了各自的优缺点，讨论了这些研究方法在植物蛋白相互作用上的应用。侧重介绍分析蛋白相互作用网络研究方法在植物蛋白相互作用研究中的应用，以期为植物蛋白相互作用研究提供参考。,引言,目前，越来越多的高等植物基因组序列被测定出，但很多基因的功能尚不明确。基因功能的研究必将定位的蛋白质功能的研究中去，然而，蛋白质功能的发挥不是凭借单个蛋白质独立执行，而是依靠蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)执行其功能，忽略蛋白之间的结构和功能联系，很难全面了解蛋白质的功能。为更好地揭示蛋白质的功能，必然要通过蛋白相互作用研究方法来阐明植物蛋白作用的复杂网络系统。大规模的蛋白质相互作用技术对于准确理解蛋白质功能、揭开各种细胞活动的奥秘具有重大的意义，势必会引导蛋白质组学的发展进入一个全盛时期,蛋白质-蛋白质相互作用研究方法,1.体内研究方法（in vivo）（1）酵母双杂交系统(Y2H)（2）生物分子荧光互补技术（BiFC）（3）荧光共振能量转移法（FRET)2.体外研究方法（in vitro）（1）免疫共沉淀法（co-IP）（2）GST融合蛋白pull-down技术（3）串联亲和纯化（TAP）技术（4）蛋白质微阵列（Protein microarrays）3.生物信息学研究方法（in silico）,酵母双杂交系统(Y2H),基本原理：转录因子GAL4可以分离为转录激活结构域（AD）和DNA结合结构域(BD),两种待检测蛋白分别和AD、BD融合表达,如果两者之间存在相互作用,则会使BD和AD结构域靠近，形成具有完整活性的转录因子并激活整合到酵母基因组上的报告基因转录，通过检测酵母的报告基因表达与否，可以反映两个蛋白质之间有无相互作用。优点:简捷(可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的繁琐步骤),高效能够比较容易地从cDNA文库或基因组文库中直接筛选出蛋白质之间相互作用的阳性克隆。敏感(高水平表达使得其能检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用),真实(接近其真实的生理状态),广泛(可以根据靶蛋白的表达部位、条件和时相的不同有针对性地采用不同组织器官细胞类型和分化期的材料构建cDNA文库)缺陷:非普遍适用性,假阳性,假阴性,结果主要为定性数据，较少定量数据，不易精确判断蛋白质相互作用的强度和变化。,生物分子荧光互补技术（BiFC）,基本原理：将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两个片段作为标记分子，将标记分子分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合并在细胞内共表达，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。优点:能检测到活体内蛋白质间相互作用发生的时间、位置、强弱,以及所形成蛋白质复合体的稳定性,特别适用于在生理条件下实时、直接、快速地对细胞内瞬时的、弱的蛋白质相互作用进行动态检测.可以在多种细胞内进行，不依赖外源的荧光素或显色剂等,能够直接报道蛋白质相互作用在细胞中发生的位置，追踪蛋白相互作用的动态过程，利用多彩的BiFC系统还可在1个细胞内研究多种蛋白质间的相互作用，是目前最灵敏的PPI检测方法。缺陷:多个BiFC系统对温度敏感，融合蛋白必须为可溶性表达，表达量过高会引起非特异性。,荧光共振能量转移法（FRET),基本原理：分别将bait蛋白、prey蛋白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和受体荧光基团(如EYFP)融合,当 bait蛋白和prey蛋白相互结合作用时,供体基团和受体基团两者之间的距离很近(约10nm),供体基团的发射光激发受体基团发射荧光。优点:比较可靠地反映蛋白质相互作用时的距离;能检测到瞬时、较弱的蛋白质相互作用;能同时检测到两蛋白的细胞分布和作用位点。缺陷:供体蛋白的激发光谱和受体蛋白的光谱可能存在重叠,影响实验结果;供体蛋白和受体蛋白的空间结构较大,限制了两者之间的距离,导致FRET发生效率低(约40%),且易出现假阴性;供体蛋白和受体蛋白的荧光亮度可能差异较大,易导致较高的背景信号。,免疫共沉淀法（co-IP）,基本原理：是利用抗原抗体的特异性结合特点来鉴定蛋白质相互作用的方法。在非变性温和条件下裂解细胞,可保持细胞内蛋白质间的相互作用,再加入诱饵蛋白抗体产生免疫沉淀反应,则与诱饵蛋白稳定结合的猎物蛋白也共同沉淀下来,再通过电泳分离、质谱鉴定具有相互作用的猎物蛋白。优点:研究的是存在于正常生理条件下蛋白质间的相互作用,可以排除蛋白质过量表达所引起的假阳性,是确定蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。缺陷:一是制备抗体过程比较繁杂,二是免疫共沉淀的灵敏度不高,受到细胞内诱饵蛋白质浓度限制,只有较高浓度诱饵蛋白质才能与抗体结合形成沉淀。三是在验证蛋白质相互作用过程中需要进行一系列的清洗操作,因此该方法不能检测到细胞中的低亲和与瞬间的相互作用,仅适用于在细胞裂解液中保持完整生理复合体的蛋白质。四是Co-IP特异性较低,洗脱混合物中往往含有较多的非特异结合蛋白。,GST融合蛋白pull-down技术,基本原理：首先诱饵蛋白(Bait protein)和GST蛋白(Glutathione-S-transferase)在细菌、动物细胞等体系中融合表达,利用GST和谷胱甘肽亲和树脂之间的高亲和性,将诱饵蛋白固化在树脂上,而固化的诱饵蛋白可以捕获细胞裂解物中的互作靶蛋白。优点:外源表达系统简单易用、蛋白表达周期短,且GST融合蛋白和谷胱甘肽有很高的亲和性,易分离出大量融合蛋白进行批量实验。缺陷:GST Pull-down的融合诱饵蛋白往往是在外源系统中表达,可能会缺少某些翻译后修饰,并且和靶蛋白的结合发生在体外环境,不能精确反映内体的相互作用,串联亲和纯化（TAP）技术,基本原理：将TAP标签融合到目标蛋白上，然后经过两步亲和纯化，获得融合蛋白及其结构关联蛋白。通过凝胶电泳、质谱等技术进一步分析鉴定。优点:操作方便、结果真实，兼具融合蛋白亲和色谱法和免疫共沉淀两种技术的优点，避免了非自然条件下的蛋白质相互作用和杂蛋白的干扰。TAP能保留蛋白复合物在细胞内的修饰和结合状态。缺陷:外源标签蛋白与内源目标蛋白在形成蛋白质复合物时存在竞争，使得可纯化的融合蛋白减少。,蛋白质微阵列（Protein microarrays）,基本原理：在固相支持物表面高密度排列探针蛋白或抗体点阵，可特异的捕捉样品中的靶蛋白，若发生相互作用，可在芯片表面形成蛋白质复合物，然后用激光共聚焦扫描仪、电荷耦合装置（CCD）或放射显像仪获取数组图像，最后用专门的计算机软件进行数据分析。优点:可以用微量样品多种参数同时进行测定缺陷:受到蛋白质固定化技术以及载体材料选择的限制，同时也需要复杂昂贵的仪器来对样品进行预处理和检测。,生物信息学方法（in silicon）,实验设计条件要求较高，其所检测出的相互作用数据间的重合度又非常低，得到的蛋白质相互作用存在大量的假阳性和假阴性数据，并且并不是所有的PPIs都能被实验方法所鉴定。生物信息学方法综合数学、化学、物理和信息科学知识，在基因组规模上研究蛋白质相互作用。有基于基因组信息的方法、基于进化信息的方法、基于蛋白质结构的方法、基于氨基酸序列的方法等，以上述方法为依据采用适当的数据库就可对蛋白质相互作用进行分析。,生物信息学方法（in silicon）,生物信息学方法在蛋白质相互作用研究中得到广泛运用,建立了大量的蛋白质相互作用数据库。,生物信息学方法（in silicon）,优点:可以获得大量信息，缩短周期，降低成本。细胞中有些蛋白质相互作用是瞬时、不稳定的，以实验为基础的研究方法较难检测到这些相互作用，而运用生物信息学则弥补实验研究方法的缺陷。局限性：方法标准多样、蛋白质相互作用数据库没有饱和，以及相互作用的结构、亲和力、特异性信息缺乏等。,总结与展望,每种技术都有自身的优缺点，研究者需要根据自己的试验目的和需要选择合适的技术方法。蛋白质相互作用研究方法和技术在植物中应用,尽管在数据获得与数据质量方面已经有很多研究技术，但植物蛋白网络图谱的覆盖率还比较低。因此，完善现有技术并发展新技术，提高对植物整体研究的高通量和灵敏性非常重要。且植物体内蛋白质组成、结构和功能的复杂性，目前的研究技术还有很多缺陷。现有的蛋白质相互作用技术远不能满足规模化、系统化的研究需要，今后很长一段时间内，蛋白质相互作用的在植物中的应用研究将主要集中在以下两个方面：创建新的研究方法和技术，并将各种蛋白质相互作用的研究技术交叉发展和耦合使用，从而更好的更准确的构建蛋白质间相互作用图谱。以实现高灵敏度、高通量、自动化、实时定性定量检测蛋白质相互作用研究技术为目的，以满足今后大规模的蛋白质相互作用的研究。,Thank You!,
