蛋白类酶的分离纯化.ppt

第四章 酶的分离纯化,1、酶分离纯化的原因（3条）2、酶分离纯化鉴定的依据蛋白质的物理化学特性（9条）,内 容,1、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法5、酶的组合分离纯化策略6、酶的浓缩、干燥与结晶,细胞结构与酶分布,3.1 酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心，过滤、沉淀、层析分离、电泳、萃取、结晶等分离方法,酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crude protein):采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partially purified):初步的纯化，使用各钟 柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。,酶分离纯化不同阶段,3.2 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎,JY92-II D超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。,3.3 酶的提取,提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。,为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质的结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含的成分,控制溶液pH值的缓冲对；控制溶液离子强度的无机盐；控制溶液氧化还原状态的还原剂；蛋白酶抑制剂离子螯合剂标准牛血清白蛋白去污剂水和防腐剂甘油,酶的主要提取方法,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。,3.4 酶的分离方法,1、沉淀分离,2、离心分离,3、过滤与膜分离,4、层析分离,5、电泳分离,6、萃取分离,1、沉淀分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。盐析的主要原理在于高浓度盐离子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋白质分子表面的水化膜，同时由于反离子作用，也影响蛋白质分子所带电荷,在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析公式 logS=logS0-KsI=-KsI,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示（指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积的比值）解读蛋白质工程p204页表73,有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,2、离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。,高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力达到 11041105 g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机超速离心机的最大转速达(2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。,超速离心有三种：差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法密度梯度离心：使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。必须预先配制好适宜的密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子量不同）梯度较浅，密度较低等密度梯度离心：分离密度不同的颗粒，欲分离颗粒处于密度梯度中的等密度点（平衡）才可停止离心，操作时先把一定浓度的介质溶液与样品液混合均匀。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，密度较高,密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度梯度系统，贮液室与混合室的截面积关系决定梯度类型。配制中，将稀溶液置于贮液室B，浓溶液置于混合室A,如图4-2(郭勇酶工程p96）流出的梯度液经过导管小心收集于离心管，如果浓溶液置于贮液室B，稀溶液置于 A室，梯度液的导液管必须直插到离心管的管底，让后来流入的浓度高的混合液将先流入的浓度较低的混合液顶浮起来形成由管口到管底逐步升高的密度梯度,超速离心机按照其用途可以分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种 蛋白质分子在离心時，其 分子量、分子密度、组成、形状 等，均会影响其沉降速率，沉降系数 即用来描述此沉降性质；其单位为 S(Svedberg unit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分离。,3、过滤与膜分离,过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。,过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。,过滤,非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质,膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质,过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同),借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择,。,膜分离,加压膜分离,微滤超滤反渗透,电场膜分离,电渗析 离子交换膜电渗析,扩散膜分离,透析,根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。,四种常用膜分离技术的基本特征,四种常用膜分离过程的截留特性,4、层析分离,层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,吸附层析 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程,。,溶剂洗脱法采用单一或混合的溶剂进行洗脱，各组分按照由弱到强的顺序先后流出，以洗脱液对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。若两峰重叠或拖尾现象出现，可采用按一定规律变化的pH梯度或浓度梯度洗脱置换洗脱法置换洗脱液中有一吸附力比被吸附组分更强的物质取代被吸附成分，后者按照吸附力由弱到强的顺序流出，以洗脱液对组分浓度作图，可得到阶梯式的洗脱曲线前缘洗脱法用含有各组分的混合溶液本身作洗脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附力最弱的组分开始最先流出。其洗脱曲线虽然也呈阶梯型，但只有吸附力最弱的组分得以和其它组分分离，仅用于分析前缘组分分析,分配层析,定义：分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法分配系数：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数,在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配,按固定相的介质分 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析分配层析按固定相的极性不同分为 正相分配层析（极性溶剂为固定相）反相分配层析（非极性有机溶剂为固定相）,离子层析,离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。,离子交换层析介质由三部分组成：惰性支持物；带电基团；（带电基团的）平衡离子通常所说的离子交换实际上是蛋白质分子与平衡离子间相互交换，他们共同竞争离子交换层析介质中的带电基团 阳离子交换层析平衡离子为阳离子，层析介质的带电基团带有负电 阴离子交换层析平衡离子为阴离子，层析介质的带电基团带有正电,1、离子交换剂的选择应根据欲分离组分的特性和要求，过强的吸附以及极端的洗脱条件都可能造成活性分子的变性失活；另外溶液的pH直接决定离子交换剂活性基团及组分离子的解离程度，从而影响了离子交换剂的交换容量和交换的选择性,选择离子交换剂时考虑因素：1）离子交换剂和组分离子的物理化学性质；2）组分离子所带电荷种类；3）溶液中组分离子的浓度高低；4）组分离子的质量大小；5）组分离子与离子交换剂的亲和力大小,2、离子交换剂的处理 1）溶胀、洗涤至澄清；2)4V 2 mol/L HCl进行酸处理，洗涤；3)4V 2 mol/L NaOH进行碱处理，洗涤；4）装柱 5）用适当的试剂进行转型处理，使离子交换剂上所带的可交换离子转变为所需离子例如，阳离子交换剂（如）用NaOH处理，转变为Na+型，用HCl处理，转变为H+型；阴离子交换剂用NaOH处理，转变为OH-型，用HCl处理转变为Cl-型,离子交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，某些大孔径的离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于酶的分离纯化。离子交换层析介质吸附蛋白的量很大，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗 处理好的离子交换剂可以在交换槽中进行分批离子交换，也可以将离子交换剂装进离子交换柱进行连续离子交换,离子层析分离过程包括1、装柱：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、无气泡、无裂缝的离子交换柱2、上柱:转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将欲分离的混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液中盐离子浓度不能过高、还要注意混合液的温度和pH值上柱时要控制合适的流速3、洗脱：洗脱液应当含有与离子交换剂的亲和力较大的离子，要通过试验确定洗脱流速。洗脱过程中，组分离子按照与交换剂亲和力由大到小的顺序先后洗出。对多组分为达到良好的分离效果，常用浓度梯度或pH梯度洗脱法，每一种又可选用阶段梯度洗脱或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。,离子层析分离过程包括,4、收集：与离子层析柱亲和力最小的组分先流出，通过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在280nm的光吸收值，同时用部分收集器收集。以洗脱体积为横坐标，以280nm的光吸收值为纵坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱峰的位置，确定不同大小的蛋白质所在试管，进一步用电泳手段鉴定目标蛋白5、交换剂再生：酸碱酸处理 碱酸碱处理,凝胶层析,凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术,凝胶层析的基本原理凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的,为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常采用分配系数Ka来量度,Ve 洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo 外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积VI 内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积,如果某组分的分配系数Ka=0，即 Ve=Vo，说明该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；如果某组分的分配系数Ka=1，即 Ve=Vo+VI，说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部的所有微孔，洗脱是最后流出；如果某组分的分配系数Ka在01，说明该组分分子大小介乎大分子和小分子之间，可以进入凝胶的微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照Ka值由小到大的顺序先后流出。,在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且 Ve=Vo+VI，所有组分都应该被洗脱出来，Ka最大值为1当Ka大于1时，说明此层析不是单纯的凝胶层析，还存在吸附层析或离子交换层析对同一类型的化合物，凝胶层析的洗脱特性与组分的相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子质量由大到小的顺序先后流出。,Ve=K1-K2 lgM,在实际应用中，常以相对洗脱体积Kav对lgM作曲线，称为选择曲线相对洗脱体积是指组分洗脱体积与层析柱内凝胶床总体积之比值KavVe/Vt,选择曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型化合物都有其各自特定的选择曲线。如此图所示，可以通过凝胶层析测定物质的相对分子质量,凝胶的选择与处理,常用的凝胶材料主要有葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，层析用的微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交联剂有环氧氯丙烷 选择凝胶主要是依据欲分离组分的分子质量大小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液的流速有一定影响，应选择大小比较均匀的商品凝胶，使用前需将凝胶于洗脱液中充分溶胀。溶胀通常采用热水溶胀（23小时），这样也达到消毒和排出凝胶内气泡的目的 溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排气即可装柱,凝胶层析操作过程,凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程装柱：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后洗脱液浸没凝胶表面。上柱：在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积的10%左右，浓度可高些，黏度应低。洗脱：洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使用的一致，体积一般为凝胶床体积的120%，洗脱流出液分步收集。,凝胶层析操作过程（详见蛋白质工程p213）,洗脱完毕后，凝胶柱已经恢复酶液上样前的状态，不需再生处理就可以重复进行下一批分离纯化。如果使用次数较多，或要纯化不同样品时，用23倍柱体积非离子去污剂除去吸附在凝胶中的杂质，或卸下凝胶，用0.2mol/L NaOH浸泡，再水洗。然后加入20%乙醇或0.04%NaN3在48长期保存,亲和层析,亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶RNA与互补的RNA分子或片段、RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用,亲和层析技术的特点是选择性很高，可减少提纯步骤 在亲和层析中,作为固定相的一方称为配基(Ligand)，配基必须偶联于不溶性母体(Matrix)上，母体又称为载体或担体。一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素作母体当小分子物质(金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等)作为配基时，由于空间位阻作用，难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度的连接臂（space arm）,要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，都必须进行母体活化。即通过某种方法，如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某种活泼基团，才能以共价键与配基偶联由于亲和结合专一性强，洗脱条件要求高。在亲和层析过程中，应控制好温度（010）、pH等条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化后期使用,常用的亲和介质及专一性配体,根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价亲和层析疏水层析(要区别疏水层析与反相层析)金属离子亲和层析（实验方法见蛋白质工程p218）免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析,金属离子亲和层析,金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白表面的组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基基团、色氨酸的吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和结合的特性，用螯合在母体上的金属离子对混合液中的目标蛋白进行纯化。要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，可改变盐浓度或pH（降低金属离子和蛋白质间的亲和常数），或采用竞争性的试剂将蛋白置换下来，可采用分级洗脱或梯度洗脱方式金属离子亲和层析的主要优点是可用不同的金属离子结合到螯合载体上，实现母体再生。,层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析结合在一起，实现组分分离的层析技术,5、电泳分离,带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。,颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。,纸电泳,自由电泳,薄层电泳,凝胶电泳,薄膜电泳,等电聚焦电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖电泳,连续凝胶电泳,梯度凝胶电泳,不连续凝胶电泳,SDS-凝胶电泳,电泳,制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。,电极缓冲液应根据欲分离组分而定。一种为阴离子电泳系统，缓冲液pH为89，上槽接负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适用于一般蛋白质和核酸的分离；一种为阳离子电泳系统，缓冲液pH为4左右，上槽接正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适用于碱性蛋白质的电泳分离电泳的实验方法主要要求看SDSPAGE和双向电泳（详见蛋白质工程p220-223）凝胶层析详见蛋白质工程p213金属离子亲和层析见蛋白质工程 p218,高效液相色谱（HPLC）,高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊的高效液相色谱柱，它使用的基质珠更小，孔径更均一，基质填充比常规层析柱更致密，因此可以耐受更大的压力，采用更快的洗脱速度，具有更高的分辨率和重复性。高效液相色谱根据凝胶介质的分离原理不同，又可分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高效疏水色谱、高效亲和色谱,6、萃取分离,萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。,按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取,有机溶剂萃取在酶的萃取过程中，有机溶剂要预冷至010，萃取过程在010低温条件下进行，并尽量缩短酶与有机溶剂接触时间,双水相萃取,双水相系统一般是指将两种亲水性的聚合物都加在水溶液中，当超过某一浓度时，产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中（每种聚合物在上下相中的分配比率不同）成相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向。双水相形成的条件和定量关系可用相图表示，对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图4-8所示。,各种双水相系统,图47 双水相系统相图,在双节线TCB下方区域是单相区，上方是双相区。T点和B点分别表示达到平衡时的上相组成和下相组成，在同一直线上的各点分成的两相，具有相同的组成，但体积比不同当系线TMB下移，长度减小，两相之间的差别逐渐减小，达到临界点C点时，系线长度为零，达到均相。,双节线的位置和形状与聚合物的分子质量有关，聚合物分子质量越高，相分离所需的浓度越低。在高分子聚合物上引入亲和配基，可以进行双水相亲和萃取双水相萃取不足：分离后酶液浓度低 高分子聚合物在分离后需要分离除去,超临界萃取,超临界萃取又称超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术 在相同的压力和温度条件下，同一物质的液相和气相的物理特性是截然不同的。当温度和压力达到某一特定的数值时，气体和液体的物理特性就会趋于相同，这个数值称为超临界点。当温度和压力超过其超临界点时，两相变为一相，这种状态下的流体称为超临界流体,图4-8 超临界系统相,超临界流体的显著特点：其物理特性和传质特性介于液体和气体之间，适于作萃取溶剂；其具有和液体同样的溶解能力，具有很高的萃取速度；随温度和压力变化，其对物质的萃取具有选择性，萃取后易分离；其黏度接近于气体的黏度，利于物质的扩散；,作为萃取剂的超临界流体必须具备以下条件：具备良好的化学稳定性，对设备没腐蚀性；临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温度附近；操作温度应低于被萃取溶质的分解温度；临界压力不能太高，节约压缩动力；选择性要好，容易制得高纯度制品；溶解度要高，可减少溶剂的循环量；萃取剂要容易获得，价格便宜,CO2超临界萃取的工艺工程由萃取和分离两个步骤组成，按分离方法不同，分离工艺过程分为：等压分离：压力相同，温度升高，溶质在CO2中溶解度降低而分离析出分离等温分离：温度相同，压力下降，溶质在CO2中溶解度降低而分离析出吸附分离：温度压力不变，分离罐中的吸附剂吸附溶质而分离溶质在超临界流体萃取中，为提高分离效果，在超临界流体中添加少量的另一溶剂，称为夹带剂，如水、乙醇、丙酮。,某些超临界流体的超临界点和超临界密度,反胶束萃取,反胶束萃取是利用反胶束将酶或蛋白从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术，更具有选择性。反胶束是超过临界胶束浓度的表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极性有机溶剂接触，而极性基团排列在内，形成一个极性核，极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，形成水池。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其它亲水物质能够进入此水池中，酶不会造成失活。,反胶束萃取中，首先要选择适宜的表面活性剂（常用阴离子表面活性剂AOT）和有机溶剂此外，反胶束萃取还受下列因素影响：（1）水相pH：对于带正电荷的表面活性剂，水相pH高于蛋白质的等电点（带负电）时，有利于蛋白质溶于反胶束中，对于阴离子表面活性剂则相反（2）离子强度：水相中的离子强度决定带电表面所赋予的静电屏蔽程度：降低表面活性剂头部基团间的静电斥力，导致反胶束颗粒变小；降低了带电蛋白质分子和反胶束带电界面间的静电相互作用,3.5 酶的组合分离纯化策略,设计分离纯化工艺的基本要求,3.6 酶的浓缩、干燥与结晶,浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。,离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。,蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩即在一定的真空条件下，使酶液在60以下进行浓缩。,在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥：边抽真空边加热，温度控制在60摄氏度以下酶液蒸发干燥 冷冻干燥：固态冰在低温真空下直接升华为气体,喷雾干燥：酶液喷成小雾滴，分散于热气流中，水分在几秒钟内蒸发，雾滴周围空气温度较低，得到干燥酶制剂。要控制好气流进口温度气流干燥：热气流直接与固体或半固态的物料接触使物料水分蒸发得以干燥。干燥时间长，酶活力损失大，要控制气流温度、速度和流向，同时要经常翻动物料，使之干燥均匀吸附干燥：密闭容器中用各种干燥剂吸收物料中的水分达到干燥目的，如硅胶、无水氯化钙、无水硫酸钙等等,结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。,要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶 等电点结晶温度差结晶,