药物定量分析与分析方法验证.ppt

第四章 药物定量分析 与分析方法验证,廖琼峰,第四章 药物定量分析与 分析方法验证,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准分析方法验证,第三节 生物样品分析方法的基本要求,第一节 定量分析方法特点,重量分析法容量分析法光谱分析法色谱分析法,一、重量分析法,生成的沉淀而进行分析的方法,生成沉淀滤过洗涤灼烧恒重。,特点：1、操作繁琐2、结果准确,很少用,第一节 定量分析方法特点,二、容量分析法,为经典方法，原料药分析常采用。,指示剂和灵敏度是影响结果的原因之一,常产生滴定误差；,特点：1、快速,准确（RSD0.2）,灵敏度高；2、适合于中、高含量组分分析（1%）；3、仪器简单，操作方便，适用范围广；,第一节 定量分析方法特点,滴定度：指每1ml某摩尔的滴定液所相当的被测药物的重量。CHP用mg来表示。aA(待测物）bB（滴定液）cCdD Tm(a/b)*M（mg/ml）百分含量计算：直接滴定法和回滴定法,第一节 定量分析方法特点,1、直接滴定法：,含量（）（VTF）W100,2、回滴定法：即剩余滴定法,先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应；待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A,第一节 定量分析方法特点,2、回滴定法：即剩余滴定法,做空白试验的含量计算：,含量(V0-VB)*T*F/W100,F：浓度校正因子=实际浓度/标准浓度,第一节 定量分析方法特点,三、光谱分析法,UV、IR、MS、NMR和荧光分析,1、紫外可见分光光度法,计算分光光度法可测定多组分制剂的含量，现已基本不用。,灵敏度和准确度高，价格低、适用范围广,一般适用于纯组分的分析，如原料药或单组分制剂（无辅料干扰）。,第一节 定量分析方法特点,灵敏度高（pg），低浓度，但适用范围有限，应用衍生化方法较多，在生物大分子分析中应用较多。,2、荧光分析法,第一节 定量分析方法特点,HPLC 适用范围广，越来越广泛GC 使用有限制TLC很少用于定量，多用于定性。,四、色谱分析法,第一节 定量分析方法特点,对内标物要求：a内标物须为原样品中不含组分b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5c内标物为高纯度物质，或含量已知物质,内标法：,内标法优点：进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 适合测定微量组分内标法缺点：制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子,与进样量无关,四、色谱分析法,1、系统适用性试验：按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应达到规定的要求应符合要求。通常包括理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子。,2、定量方法：面积归一化法，内标法、标准曲线法、外标法等。,第一节 定量分析方法特点,（1）条件选择范围宽：包括色谱柱、流动相、检测器等。（2）应用范围宽：以HPLC为最广泛。（3）灵敏度高，准确度好，重现性好。（4）操作繁琐，实验消耗大。（5）多组分的分离分析，与光谱等联用，可进 行定性和定量分析。,3、色谱法特点：,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、目的,证明所用的分析方法适合于相应的检测要求。,二、用途,1、药品质量标准起草时，,2、药物生产工艺方法变更、制剂组成改变、对原分析方法进行修订。,方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,验证分析项目,1.鉴别试验；2.杂质定量或限度检查；3.有效成分含量测定；4.制剂中其它成分(降解产物、防腐剂等)的测定；5.溶出度、释放度等功能检查中，溶出量 的测定方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,验证内容,1 专属性 2 检测限 3 定量限 4 精密度 5 线性及其范围 6 准确度 7 耐用性,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、专属性（specificity）,1、定义：指在其他成分（杂质和制剂辅料等）可能存在下,采用的方法能准确测出被测物的能力。,2、意义：分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰程度的一种方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定(6)阴性对照溶液制备 按处方比例称取除西洋参以外的其余药味，按制备工艺制成缺西洋参的阴性样品；按“供试品溶液制备”项下方法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取20 L进样，观察样品峰的保留时间处是否有杂质峰。测得结果表明：样品峰保留时间处无杂质峰干扰（见附图2-1）。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,图2-1 定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定HPLC色谱图1-人参皂苷Re 2-人参皂苷Rb1,A-对照品,B-样 品,C-阴 性,二、检测限(limit of detection,LOD),1、定义：试样中被测物能被测出的最低浓度 或量。,2、意义：LOD 是一种限度检验的效能指标,它反映方法与仪器的灵敏度和噪音大小，也表明样品经处理后空白值的高低。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、测定法：,用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,（1）非仪器分析目视法,（2）仪器分析,一般以信噪比(S/N=3或2)时的相应浓度或注入仪器的量确定为检测限。,4、数据要求,附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,三、定量限（1imit of quantitation，LOQ）,1、定义：样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。,2、测定法：（1）以信噪比（S/N）为10时相应的注入仪器的药物浓度或量进行确定。,（2）以仪器所测空白背景响应标准差(SD)的10倍为估计值，再经试验确定。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,1、定义：在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。,四、精密度,2、表示方法：偏差（d）：标准偏差(SD):相对标准偏差(RSD):,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、表达形式：,（1）重复性：相同条件下，同一个分析人员测 定所得结果的精密度；,测定法：,至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度样品测三次。,把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、表达形式：,（2）中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。,目的：,日期、分析人员、设备,考察随机变动因素的影响,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（3）重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。,3、表达形式：,当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定(7)方法重复性试验取同一批号定坤胶囊样品6份(20041025),按“供试品溶液制备”项下方法操作，平行制备6份样品，在上述色谱条件下进行分析，测定，按人参皂苷Rb1的含量计算：RSD=1.8%(n=6)。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围,线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。,1、定义：,范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、要求：线性范围要涵盖待测物的所有浓度 范围。,4、数据要求：应列出回归方程、相关系数 和线性图。,2、测定法：设计具有一定梯度的58个浓度点，用作图法或计算回归方程建立.Y=ax+b 0.999(相关系数）,第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围,(3)标准曲线绘制 取人参皂苷Rb1对照品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为103.0 gmL-1的对照品储备液。依次精密量取对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成人参皂苷Rb1系列标准溶液。分别精密吸取20 L，按上述色谱条件下测定。以对照品浓度X(gmL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得回归方程：回归方程为：Y=2.146103 X+2.236103（=0.9998，n=6）结果表明人参皂苷Rb1在10.3-103.0 gmL-1浓度范围内，Y与X之间具有良好线性关系。,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,六、准确度,1、定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。,2、测定法：用百分回收率（R）表示，测定回 收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（1）回收试验法 空白B+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,考察辅料对回收率是否有影响。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（2）加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,R=,测得量-本底量,加入量,100%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,(8)回收率试验 采用加样回收法，称取已知含量的同一批号定坤胶囊样品9份（20041025），每份0.2 g，精密称定。按低、中、高浓度分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液，每一浓度3份，按“供试品溶液制备”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。测得方法平均回收率为99.7%（RSD=1.7%，n=9），数据见Tab.4-1。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,Tab.4-1 Recovery of ginsenoside Rb1 in Dingkun capsule,3、数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，每一浓度测定三次。,RSD2%,（1）原料药、制剂 UV、HPLC：R=98102%容量法：R=99.7100.3%（2）中药及其制剂,95105%,90110%,RSD5%,RSD3%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,4.判断含量测定方法准确度的方法,（1）回收率试验,（2）与已建立准确度的另一方法测定的结果 进行比较。,“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,1、定义：指测定条件稍有变动时，结果不受 影响的承受程度。,七、耐用性,2、意义：为常规检验提供依据，是衡量实验 室和工作人员之间在正常情况下实 验结果重现性的尺度。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,效能指标的选择,非定量分析,定量分析,微定量分析,一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,一、生物样品的种类、采集、制备和贮藏,（一）种类：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（二）生物样品的采集和制备,1、血液（blood）血浆、血清和全血,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,体现药物浓度和治疗作用之间的关系。最常用的生物样本。,（1）血样的采集：注射器、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、滞留针股静脉取血,动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。,（2）血样的制备：,测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。,血浆（plasma）的制备,肝素（最常用）、EDTA、椐橼酸盐、草酸钙、氟化钠。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,血清（serum）的制备,血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%60%，血清只为全血的20%40%，多数研究者用血浆进行分析测定。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,全血（whole blood）的制备,血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,最常用的生物样本。,2、唾液（saliva）,一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关，因此：,TDM中利用对S的测定代替对P的监测药代动力学的研究,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（1）唾样的采集：,在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。物理法(口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等)化学法(将柠檬酸或维生素C等置于舌尖)弃去初始部分后采集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,刺激法的优点缩短采样时间减小唾液pH波动（pH7.0）S/P的个体差异小,（2）唾样的制备唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,3、尿液（urine）,体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、相及相代谢物等多种形式排出。,尿液的采集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定。,尿液的采集,（1）尿样的采集：,测定方式测定一定时间内排入尿中的药物总量,样本采集时间尿（在规定时间区间内采集）,并测量每次收集的尿液体积。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（三）生物样品的贮藏,最常用的方法冷藏或冷冻,冷藏冰箱(4)中短期保存(12d)冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80)中长期保存,冷藏或冷冻的时限：经稳定性考察后确定,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1、血样的贮藏 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再贮存。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2、唾液样品的贮藏 测定唾液pH时应在取样的当时测定。为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4以 下保存 冷冻保存唾液时，解冻后应用前摇匀。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,3、尿样的贮藏 采集后应立即测定（24h），若不能立即测定，加入防腐剂后保存。,保存时间为2436h(4)或长期(-20),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（四）生物样品分析的前处理技术,1.生物样品分析前处理的目的,在测定体内药物及其代谢物时，首先需对复杂的生物样品实施分离、净化、浓集、化学衍生化等样品预处理过程为药物的最终测定创造良好条件，具体表现在四个方面：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,(1)使药物从缀合物及结合物中释放测定药物的总浓度(2)使样品纯化消除生物基质中内源性物质的干扰(3)提高检测灵敏度适应和符合测定方法要求的灵敏度(4)防止分析仪器的污染和劣化提高分析仪器的耐受程 度、改善分析结果,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1.生物样品分析前处理的目的,2.生物样品分析前处理的技术,生物样品的预处理大致分为以下五类（1）去除蛋白质（2）缀合物的水解（3）分离、纯化与浓集（4）化学衍生化（5）有机破坏法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（1）去除蛋白质,目的：结合型药物释放、减少乳化的产生、保护仪器,常用方法：,加入与水混溶的有机溶剂蛋白质脱水沉淀 加入中性盐“盐析”沉淀蛋白质 加入强酸与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀 加入重金属盐与蛋白质阴离子(羧基)形成盐沉淀 酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,加入与水相混溶的有机溶剂,常用的有机溶剂乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等血样与溶剂的体积比1(1-3)除去90%以上蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min,上清液pH pH8.59.5,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,加入中性盐,常用中性盐饱和(NH4)2SO4、Na2SO4、Mg2+、PO43-及枸橼酸盐等试剂用量血样与饱和(NH4)2SO4的比例为 12时除去90%以上的蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min上清液pH pH7.07.7,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,加入强酸,常用的强酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等试剂用量血清与强酸的比例为10.6时除去90%以上的蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min上清液pH pH 04,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,加入含锌盐及铜盐的沉淀试剂,当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀。常用的沉淀剂 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等 血清与沉淀剂的比例1(13)，90%以上离心分离高速(10000r/min)离心12min 上清液pH分别为5.77.3和6.57.5,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,酶解法,加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。最常用的酶蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（）缀合物的水解（自学）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（3）分离、纯化与浓集,目的：a消除内源性物质、代谢物及其他共存 物质的干扰；b提取浓缩待测物质，使其易于检测,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,液液萃取法(传统的方法)固相萃取法(液固萃取法)自动化固相萃取技术固相微萃取膜萃取技术微透析技术超临界流体萃取法,方法：,（3）分离、纯化与浓集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,A：溶剂的选择试验成功的主要条件 相似相溶的原则 对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶 沸点低、易挥散，毒性小 与水不相混溶 具有较高的化学稳定性和惰性,液液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,萃取次数通常为1次(萃取R在70%以上)必要时23次(萃取R在50%以下)每次用量和水相的体积比通常为1:1或25:1 萃取方式分液漏斗或涡流混合,B：萃取方法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,C：水相pH值,水相pH值药物的pKa确定90%以上的非电离形式,碱性药物最佳pH值：高于pKa值12个 pH单位酸性药物最佳pH值：低于pKa值12个pH单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值 介质中提取；,生物样品宜在碱性或近中性提取生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,pH=13,pH=7,pH=2,空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2.固相萃取法（Solid-phase extraction,SPE）,SPE原理将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,洗脱方式A:药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一 种对药物亲和力更强的溶剂洗脱B:杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱 通常为A模式，前应用最广泛的微型柱Bond Elut（美国Analytichem International公司）和Sep-pak微型柱（美国Waters公司）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,固相的选择,原则固相与被测组分应具有相似的极性,SPE的填料种类繁多，可分成三类1）亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）2）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）3）离子交换型,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,试验步骤五步,1）用甲醇活化填料固相表面可被水性溶液润湿2）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的甲醇3）加样使样品经过小柱，弃去废液4）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的干扰物5）选择适当的洗脱溶剂冲洗小柱洗脱被分析物，收集 洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,方法特点,优点：1）引入杂质少 2）完全避免乳化的形成 3）较高萃取率、重现性较好 4）使用溶剂多数与水混溶，易于自动化 缺点：1）价格昂贵 2）技术要求高,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（4）化学衍生化,药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化如R-COOH、R-OH、R-NH2、R-NH-R,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1）GC法中的化学衍生化,目的：a:使极性药物变成非极性、易挥发药物；使具有被分离特性 b:增加药物的稳定性 c:提高对光学异构体的分离能力,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1）GC法中的化学衍生化,主要衍生化反应：,a:烷基化（Alkylations）b:酰化（Acylations）c:硅烷化（Silylations）应用最广泛d:非对映体衍生化（to produce diastereomers）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2）HPLC法中的化学衍生化,A-目的：a:提高对样品的检则灵敏度 b:改善样品混合物的分离度 c:进一步结构鉴定(如MS、IR、NMR),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2）HPLC法中的化学衍生化,B-化学衍生反应的要求 a:反应条件不苛刻、能迅速定量进行 b:生成单一衍生物，反应副产物、包括过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测 c:衍生试剂方便易得、通用性好,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2）HPLC法中的化学衍生化,柱前衍生法是在色谱分离之前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。,C-HPLC衍生化可分为柱前衍生法与柱后衍生法两种,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,柱后衍生法是在色谱分离(出柱)后，色谱流出组分直接在系统中与衍生试剂及辅助反应液进行反应，在线检测衍生化产物。,柱前衍生和柱后衍生的主要差别 柱前衍生根据衍生物的性质不同而进行色谱分离的 柱后衍生根据待测物的性质分离后再衍生 为保持较高的反应产率和重现性结果，一般要求加 过量的衍生试剂，对柱后衍生的方式不利 对大量样品做常规分析，柱后衍生更适合于连续的 自动化操作,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,D-根据衍生化目的和试剂不同，衍生化反应分四种,HPLC紫外衍生化反应,HPLC荧光衍生化反应,HPLC电化学衍生化反应,HPLC手性衍生化反应,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,四、生物样品定量分析方法的验证与要求,1专属性避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际状况相符4精密度结果可重现5定量下限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保准确度 8.质量控制 9.测定要求,学科热点问题,游离型血药浓度测定方法研究血中游离型药物浓度(F)与总浓度(T)的比率(F/T)及唾液与血液游离浓度的比率(S/P)以及它们之间的相关性的研究代谢物的监测与研究对映体的监测与研究体内微量元素的测定与研究方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究分析新方法、新技术的联用研究体内药物分析方法的质量控制研究,参 考 文 献,中国药典2005版,药品质量标准分析方法验证指导原则,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则,思考题,1 药品质量标准分析方法验证有哪些内容，各项内容的含义及其表示方式2 药品质量标准各项分析项目各需要哪些方法验证内容3 有哪些生物样品种类，各类样品的采集和贮藏方法4 生物样品去除蛋白质的目的和方法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,