药物分析课件甾体激素类药物的分析.ppt

第十章 甾体激素类药物的分析,甾体激素类药物（steroid hormone drugs）：是指分子结构中含有甾体母核的激素类药物。分子结构中均具有环戊烷并多氢菲母核，是临床上较为重要的一类药物。来源：天然物、人工合成品。如：氢化可的松、睾酮、雌二醇、黄体酮等。中国药典收载本类药物及其各种制剂97个品种。,第一节 基本结构和分类,一、基本结构：环戊烷并多氢菲母核,二、分类与结构特征,分类 两大类 肾上腺皮质激素 性激素 简称皮质激素 雄性激素与蛋白同化激素 雌激素、孕激素,（一）肾上腺皮质激素,本类药物均可视作皮质酮的衍生物（I）皮质酮（II）氢化可的松 corticosterone hydrocortisone,（III）地塞米松磷酸钠（IV）醋酸氟轻松,主要结构特征,（1）A环的C3上有酮基；C4/C5间有双键，并与C3酮基共轭，称为，-不饱和酮，标记为4-3-酮。（2）D环的C17上有-醇酮基（-ketol）侧链（）。（3）合成甾体抗炎药在结构上多具有C1/C2间双键；C6-、C9-卤素；C16-羟基、甲基；C17-羟基等取代基。如：地塞米松磷酸钠、醋酸氟轻松。,（二）雄性激素与蛋白同化激素,睾酮（睾丸素）衍生物某些蛋白同化激素在C10上无19-角甲基，如苯丙酸诺龙。中国药典收载的原料与制剂：丙酸睾酮、十一酸睾酮、甲睾酮、硫酸普拉睾酮钠。（V）睾丸素（VI）苯丙酸诺龙 testosterone nandrolone phenylpropionate 可供分析主要结构特征：A环的4-3-酮结构,（三）雌激素,雌二醇及其C17-羧酸酯类：戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇 C17-乙炔基衍生物：炔雌醇、炔雌醚、尼尔雌醇（VII）雌二醇 estradiol（VIII）炔雌醇ethinylestradiol可供分析结构特征（1）A环苯环，具有C3-酚羟基；（2）D环的C17上具有-乙炔基。,（四）孕激素（黄体激素）,黄体酮及其衍生物如：己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮（IX）黄体酮 progesterone可供分析结构特征：（1）A环具有4-3-酮结构（2）D环的C17上有甲酮基（ketone）侧链（）,（五）其它,中国药典收载的口服避孕药：炔诺酮及衍生物如：炔孕酮、炔诺孕酮、左炔诺孕酮（X）炔诺酮 norethisterone结构特征：在结构上具有上述各类性激素的特征（1）A环具有4-3-酮结构（皮质激素、雄性激素、孕激素类）（2）D环的C17上多具有-炔基（雌激素类）（3）C10上多无19-角甲基（雌激素类）,炔诺孕酮 炔孕酮（norgestrel）（ethisterone）,第二节 鉴别试验,与强酸的呈色反应官能团的反应测定衍生物熔点酯类的反应紫外分光光度法红外分光光度法薄层色谱法高效液相色谱法,一、与强酸的呈色反应,甾体激素 硫酸（硫酸-乙醇）、磷酸、高氯酸、盐酸 呈色反应机理：4-3-酮 浓硫酸 质子化 正碳离子（共轭体系）显色 表10-2 某些甾体激素与硫酸的呈色反应（溶液颜色、溶液荧光、加水稀释后现象）特点：甾体母核反应，操作简便，不同甾体形成溶液颜色或荧光各不相同，可以互相区别。但专属性稍差，反应较灵敏。操作中对取样量和试剂用量要求较为严格。中国、英、日国家药典采用此方法中国药典鉴别醋酸可的松,二、官能团的反应,酮基的反应C17-醇酮基的反应甲酮基或活泼亚甲基的反应酚羟基的反应氟元素的反应乙炔基的反应,（一）酮基的反应,4-3-酮、C20-酮基+羰基试剂 呈色（异烟肼、硫酸苯肼、2,4-二硝基苯肼）+HCl 黄体酮 异烟肼 黄色反应速度:4-3-酮（即刻反应）1,4-3-酮(13min)C20-酮基(更长时间),(二)C17-醇酮基的反应,皮质激素分子结构中 C17 位上的-醇酮基 还原性 氧化剂氧化 被还原析出沉淀或显色 水合醛氧化剂：碱性酒石酸铜试液、氨制硝酸银试液、碱性四氮唑试液,与碱性酒石酸铜试液反应(斐林试液),+2Cu2+4OH-醋酸泼尼松+Cu2O+2H2O 红色 水合醛,2.与氨制硝酸银试液反应(多伦试液),+2Ag+2OH-醋酸去氧皮质酮+2Ag+CH3COOH 黑色,3.与碱性四氮唑试液反应,四氮唑盐:氯化三苯四氮唑(TTC);蓝四氮唑(BT)结构如下:还原 还原 单甲（红色）双甲（蓝色）应用：-醇酮基的鉴别皮质激素中“其他甾体”TLC检出试剂含量测定显色试剂 TTC BT,反应原理如下：,+H2O 醋酸泼尼松 TTC+CH3COOH 水合醛 深红色,（三）甲酮基或活泼亚甲基的反应,亚硝基铁氰化钠 间二硝基苯 芳香醛 呈色甲酮基的反应亚甲基的反应,1.甲酮基的反应,黄体酮约5mg 至置小试管中 加甲醇0.2ml 加亚硝基铁氰化钠的细粉约3mg、碳酸钠及醋酸铵各约50mg 摇匀 放置1030min 显蓝紫色 含有C17-甲酮基的黄体酮的灵敏、专属的鉴别方法,甲酮基的反应原理,+Fe(CN)5(NO)2-+2OH-黄体酮+2H2O 配位阴离子 蓝紫色,2.亚甲基的反应,硫酸普拉睾酮钠约10mg，加乙醇1ml溶解，加间二硝基苯约10mg使溶解，加氢氧化钠试液数滴 显紫红色+OH-+H2O 共轭结构（紫红色）,(四)酚羟基的反应,雌激素类具有C3位酚羟基，C4位（芳香环的位）上的氢较为活泼，能与重氮苯磺酸偶合生成红色偶氮化合物。+苯甲酸雌二醇 红色偶氮化合物,(五)氟元素的反应,含氟甾体激素类药物（醋酸氟轻松 醋酸地塞米松）氧瓶燃烧 无机氟化物 茜素氟蓝 硝酸亚铈 蓝紫色,(六)乙炔基的反应,+AgNO3+HNO3 白色乙炔盐沉淀,三、测定衍生物熔点,甾体激素类药物 甾体激素酯类 试剂 反应 醇制碱液 水解 酯、肟、缩氨基脲 游离甾体 测熔点,（一）酮肟的生成,+HONH2+H2O（盐酸羟胺醋酸钠试液）炔诺孕酮 沉淀 滤过 水洗 重结晶 测熔点约为195C，熔融同时分解,（二）缩氨基脲的生成,+H2NCONHNH2（盐酸氨基脲试液）苯丙酸诺龙+H2O 熔点约为180C,四、酯类的反应,甾体激素多以羧酸酯类用药 水解 乙醇制氢氧化碱 游离羧酸 乙醇、硫酸（12）共热 羧酸乙酯 蒸除乙醇与硫酸共热 香气 产生羧酸特臭,五、紫外分光光度法,多数甾体激素类药物 共轭体系 紫外吸收（规定 max、A、Amax/Amin）,六、红外分光光度法,甾体药物结构复杂 红外光谱鉴别各国药典收载的甾体激素类药物，几乎都采用红外光谱作为鉴别方法之一。中国药典收载甾体激素原料药40种，37种采用红外光谱作为鉴别。表10-3 甾体激素某些基团的特征吸收频率,七、薄层色谱法,薄层色谱法（TLC）一些国家用作甾体激素类药物制剂的主要鉴别方法之一。中国药典用TLC鉴别的药物和制剂有十余个品种。例：醋酸泼尼松片的鉴别 薄层板：硅胶G板 展开剂：二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（385:60:15:2）显色剂：碱性四氮唑蓝 对照品：醋酸泼尼松,八、高效液相色谱法,HPLC鉴别法：一般采用在含量测定项下记录的HPLC图中供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。特点：简便、快速、高分离效能。中国药典采用HPLC鉴别醋酸氟轻松软膏等十余个品种。,第三节 特殊杂质检查,杂质：原料、中间体、异构体、降解产物、试剂、溶剂。检查项目：特殊杂质（有关物质）“其他甾体”（主要）其它检查项目 地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠 游离磷酸 地塞米松磷酸钠 甲醇、丙酮 醋酸氟轻松 氟 炔诺孕酮 乙炔基 醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、泼尼松龙 硒,一、游离磷酸,来源：磷酸酯化时残存的过量磷酸检查方法：钼蓝比色法原理：磷酸+钼酸铵 酸性溶液 磷钼酸铵 还原 磷铵酸蓝（钼蓝）=740nm 有最大吸收 例：中国药典收载的地塞米松钠的检查 结果：在740nm处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得 大于对照溶液的吸收度。,二、甲醇和丙酮,地塞米松磷酸钠中甲醇和丙酮的检查来源：在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮检查：气相色谱法规定：含丙酮不得过0.5%(g/g)，含甲醇不得 过0.3%(g/g)。为什么药典规定作甲醇与丙酮残留量检查？由于甲醇对人体有害，若用丙酮冲洗数次即可除尽甲醇。故药典规定采用气相色谱法测定时不得出现甲醇峰。,三、硒,来源：生产中使用二氧化硒脱氢工艺检查原理：氧瓶燃烧法破坏 Se（VI）盐酸羟胺 Se（IV）2,3-二氨基萘 pH2 4,5-苯并硒二唑 环己烷提取 378nm最大吸收测定供试品溶液和对照品溶液在378nm波长处的吸收度并进行比较，来判断供试品中的硒是否超过了限量。,四、其他甾体,其他甾体（有关物质）甾体激素类药物主要杂质 限量检查 甾体激素药物纯度检查重要项目 检查方法 TLC、HPLC,（一）薄层色谱法,1.方法：主成分自身对照法（高低浓度对照法）即将供试品制成高、低二种浓度的溶液。高浓度溶液作为供试溶液；低浓度作为对照溶液。2.判定法：供试溶液图谱中杂质斑点的数目和颜色与对照溶液图谱的主斑点进行比较，即通过杂质总数和各单一杂质的量进行控制。3.检查示例：醋酸氟轻松中其他甾体的检查薄层板：硅胶G 结果判断：供试品溶液如显杂质斑点，不展开剂：氯仿-甲醇（97:3）得多于2个，其颜色与对照显色剂：四氮唑蓝 溶液的主斑点比较，不得更深。,（二）高效液相色谱法,1.色谱条件2.方法：主成分自身对照法或面积归一化法3.判定法：供试溶液的色谱图中杂质峰的数目和各单一杂质峰面积及其总和，与对照溶液的主峰面积比较或用归一化法计算相对含量。4.检查示例：甲睾酮中其他甾体的检查法 结果判断：供试溶液如显杂质峰，不得超过3个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于对照溶液主峰面积的1/2和3/4。,第四节 含量测定,依据：不同类别的特征基团的性质方法：紫外分光光度法、比色法、色谱法 高效液相色谱法 紫外分光光度法 四氮唑盐比色法 异烟肼比色法 柯柏比色法,一、高效液相色谱法,2000年版收载甾体激素类原料药与各种制剂97种，65个品种采用HPLC测定含量。RP-HPLC：色谱柱填料（ODS）流动相（甲醇-水 or 乙腈-水）；少数药物使用磷酸盐或醋酸盐缓冲液；流动相中加冰醋酸或三乙胺；个别药物在流动相中加入四氢呋喃、异丙醇、乙醚等有机改性剂，以改善峰形、提高分离效能。检测：4-3-酮或苯 紫外检测，检测波长240nm或280nm附近。示例：黄体酮、地塞米松磷酸钠含量测定（祥见讲义）,二、紫外分光光度法,max=240nm or 280nm附近 UV测定UV法专属性较差（相对于HPLC），但简便易行，有可靠的准确度。在中国药典中UV法应用仅次于HPLC。,三、四氮唑盐比色法,反应原理同前四氮唑盐还原产物在可见光区有最大吸收，反应可定量完成，生成的有色甲 具一定稳定性，可用于甾体激素类药物的比色分析。测定方法及反应各种影响因素祥见讲义,自学内容,四、异烟肼比色法五、柯柏比色法,