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第八章 生物碱类药物的分析,生物碱（alkaloids）：是一类存在于生物体内的含氮的碱性有机药物，绝大部分存在于植物体内，大多有强烈的生理活性。生物碱大都有毒性。目前已分离到生物碱3000多种，近百种具有强烈生理活性。药物的结构和性质鉴别试验特殊杂质的检查含量测定,第一节 药物的结构和性质,六类苯烃胺类托烷类喹啉类异喹啉类吲哚类黄嘌呤类,一、苯烃胺类（麻黄碱、伪麻黄碱、秋水仙碱、益母草碱）,HCl HCl 盐酸麻黄碱 盐酸伪麻黄碱 秋水仙碱Ephedrine hydrochloride pseudoephedrine hydrochloride colchicin,结构特征和性质,1.苯烃胺结构 N原子在侧链上 脂肪胺 碱性强 易与酸成盐2.芳环和不饱和双键 紫外区有吸收3.不对称碳原子 手性特征 比旋度:盐酸麻黄碱 33C 35.5C 盐酸伪麻黄碱+61.0C+62.5C 秋水仙碱(左旋体)425C 450C,二、托烷类（颠茄生物碱类、古柯生物碱类）,H2SO4 H2O HBr 2 硫酸阿托品 氢溴酸山莨菪碱 atropine sulfate anisodamine hydrobromide,结构特征和性质,1.酯类生物碱 莨菪烷衍生物+莨菪酸 缩合 酯类生物碱 易水解 2.N原子 N原子位于五元脂环 碱性较强 易与酸成盐3.不对称碳原子 硫酸阿托品 外消旋体 无旋光性 氢溴酸山莨菪碱 左旋体 比旋度:9.0C11.5 C 4.性状 硫酸阿托品:无色结晶或白色结晶性粉末 氢溴酸山莨菪碱:白色结晶或结晶性粉末,三、喹啉类（奎宁、奎尼丁、喜树碱）,H2SO4 2H2O H2SO4 2H2O 2 2 硫酸奎宁 硫酸奎尼丁 quinine sulfate quinidine sulfate,结构特征和性质,1.N原子碱性 喹啉环+喹核碱 各含一个N原子(芳环N)碱性(脂环N)碱性 与硫酸成盐 不能2.不对称碳原子 奎宁;奎尼丁 分子式相同;喹核碱部分的立体结构不同(左旋体)(右旋体)3.荧光特性（硫酸奎宁、硫酸奎尼丁在硫酸溶液中显蓝色荧光）4.溶解性、药理作用 不同 奎宁 氯仿-无水乙醇（2:1）易溶 奎尼丁 沸水；乙醇易溶,四、异喹啉类（吗啡、可待因、罂粟碱、那可汀）,盐酸吗啡 磷酸可待因 morphine hydrochloride codeine phospate,结构特征和性质,1.酸碱性 吗啡分子(叔胺基团+酚羟基)两性化合物 碱性略强 可待因分子(叔胺基团,无酚羟基)碱性较吗啡强2.溶解性 吗啡、可待因在常用的有机溶剂（氯仿、乙醚）中，溶解度均较小。,五、吲哚类(士的宁、利血平、麦角新碱、长春碱、长春新碱、毒扁豆碱、钩藤碱),硝酸士的宁 利血平 strychnine nitrate reserpine,结构特征和性质,1.碱性：两个碱性强弱不同的N原子 脂肪链上N1 吲哚N2 叔胺碳碱性较强 与芳环共轭几乎无碱性士的宁：pKb1 为6.0(与一分子硝酸成盐)pKb2 为11.7利血平：N1 受立体效应影响，碱性极弱 pKb1 为7.93（不与酸成盐）2.性状、溶解性士的宁：无色针状结晶或结晶性粉末，沸水中易溶，水中略溶，乙醇或氯仿中微溶，乙醚中几乎不溶。利血平：白色或淡褐色结晶或结晶性粉末，氯仿中易溶，丙酮或苯中微溶，水、甲醇、乙醇、乙醚中几乎不溶。比旋度测定用氯仿作溶剂，比旋度-115C-131C,六、黄嘌呤类（咖啡因、茶碱）,咖啡因 茶碱 caffeine theophylline,结构特征和性质,1.结构特征：咪唑和嘧啶相骈合的双杂环化合物2.分子结构含四个氮原子 受邻位羰基吸电子基团影响，碱性弱，不易与酸结合成盐 临床应用为游离碱。3.茶碱分子中含活泼氢 可与乙二胺成盐,第二节 鉴别试验,生物碱类药物的一般鉴别反应 熔点测定法 紫外分光光度法 显色反应 红外分光光度法 沉淀反应 色谱法生物碱类药物的特殊鉴别反应 双缩脲反应 Vitaili反应 绿奎宁（Thakkeioquin）反应 紫脲酸铵反应 Marquis反应,一、生物碱类药物的一般鉴别反应,（一）熔点测定法：ChP：可可碱、氨茶碱、磷酸可待因 BP：茶碱（二）显色反应：生物碱+生物碱显色剂 脱水、氧化、缩合 不同的颜色（浓硫酸、浓硝酸、钼硫酸、钒硫酸、硒硫酸、甲醛硫酸）（三）沉淀反应：生物碱+重金属盐类、大分子酸类沉淀剂 沉淀(碘化铋钾、碘化汞钾、碘-碘化钾、二氯化汞)(难溶盐、不溶性盐 复盐、络盐沉淀),生物碱类药物的一般鉴别反应,（四）紫外分光光度法：芳环、共轭双键 1.比较最大吸收波长、最小吸收波长、相应吸收度变化值 2.与对照品比较吸收光谱的一致性 3.比较吸收系数的一致性（五）红外分光光度法：反映分子结构的细微特征，准确度高，专属性强 鉴别药物真伪的有效方法。（各国药典广泛采用，鉴别生物碱的主要方法之一）标准红外光谱对照法；对照品对比法,生物碱类药物的一般鉴别反应,（六）色谱法：常用于生物碱类药物的鉴别 薄层色谱法 最常用关键问题：拖尾现象 应使生物碱以游离形式存在！解决办法：展开剂中加碱性试剂 制薄层板时硅胶中加入碱性试剂,二、生物碱类药物的特殊鉴别反应,（一）双缩脲反应：芳环侧链具有氨基醇结构的特征反应（盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱）盐酸伪麻黄碱Cu2+仲胺基紫堇色配位化合物无水、2分子水的配位化合物易溶于乙醚 紫红色4分子水配合物溶于水层蓝色 蓝紫色，加乙醚，醚层紫红色 水层显蓝色,生物碱类药物的特殊鉴别反应,（二）Vitaili反应：托烷类生物碱的特征反应 山莨菪碱水解产物+3HNO3+3H2O 莨菪酸三硝基衍生物（黄色）+KOH+H2O+CO2 深紫色,生物碱类药物的特殊鉴别反应,（三）绿奎宁反应：含氧喹啉衍生物的特征反应 Br2 NH3 H2O 翠绿色,生物碱类药物的特殊鉴别反应,（四）紫脲酸铵反应：黄嘌呤类生物碱的特征反应 HCl NH3 KClO3 紫色（加NaOH试液，紫色消失）,生物碱类药物的特殊鉴别反应,（五）甲醛-硫酸反应（Marquis反应）含酚羟基异喹啉生物碱的特征反应 吗啡、乙基吗啡、可待因+甲醛-硫酸 有色化合物 醌式结构例：盐酸吗啡 紫色,第三节 特殊杂质的检查,一、显色反应：1.盐酸吗啡中阿扑吗啡的检查:杂质来源:吗啡 酸性溶液 脱水 分子重排 阿扑吗啡 杂质检查:水溶液 碳酸氢钠碱性 I2氧化 水溶性绿色化合物(溶于乙醚深宝石红色)杂质限量:规定50mg药物经检查醚层和水层不得显色.2.盐酸吗啡中罂粟酸的检查:杂质来源(提取时引入)杂质检查:罂粟酸 微酸性溶液 FeCl3 罂粟酸铁(红色)杂质限量:规定0.15g药物中不得显色3.磷酸可待因中吗啡的检查:杂质来源(可待因合成中甲基化不完全引入吗啡)杂质检查:吗啡+亚硝酸钠 2-亚硝基吗啡(氨碱性黄棕色)杂质限量:0.10%,二、旋光度法,利用生物碱类药物与特殊杂质旋光性质的差异例：硫酸阿托品中“莨菪碱”的检查：（消旋）（左旋）消旋不完全引入 杂质限量：供试品溶液浓度50mg/ml,旋光度不得过-0.4。限量：24.6%。（已知莨菪碱 为-32.5）,三、色谱法,利用生物碱类药物与特殊杂质在色谱行为上的差异主要以薄层色谱法为主（碱性试剂，防止拖尾）例：中国药典硫酸奎尼丁中其它金鸡纳碱的检查祥见（P206）中国药典硫酸长春碱中其它生物碱的检查 BP氢溴酸东莨菪碱中易氧化物的检查祥见（P211）中国药典、BP氧氟沙星有关物质的检查祥见（P207）,第四节 含量测定,生物碱类药物的含量测定多利用其碱性非水溶液滴定法提取酸碱滴定法酸性染料比色法高效液相色谱法气相色谱法,一、非水溶液滴定法,（一）原理和方法：游离生物碱：B+HClO4 BH+ClO 生物碱盐：BH+A+HClO4 BH+ClO+HA（置换反应）测定方法：取经适当方法干燥的供试品适量，加冰醋酸1030ml溶解。若供试品为氢卤酸盐，应加5%醋酸汞的冰醋酸溶液35ml，用0.1mol/L的高氯酸滴定液滴定至终点，并将滴定结果用空白试验校正。在冰醋酸中，只要在水溶液的Kb 值大于10-10，都能顺利滴定。,非水溶液滴定法,（二）问题的讨论：1.适用范围：在水溶液中不能被滴定的生物碱及盐 Kb 10-10 冰醋酸 Kb 10-10 10-12 冰醋酸+醋酐 Kb HBr H2SO4 HCl HSO HNO3 生物碱氢卤酸盐:加入醋酸汞的冰醋酸溶液 卤化汞 排除干扰,非水溶液滴定法,3.指示终点的方法:电位法、指示剂法 指示剂的终点判断需用电位法确定 结晶紫 碱式色（紫）酸式色（黄）（紫、蓝紫、蓝、蓝绿、绿、黄绿、黄）滴定较强碱 蓝色 硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱 碱性次之 蓝绿色或绿色 二盐酸奎宁、马来酸麦角新碱 滴定较弱碱 黄绿或黄色 咖啡因,非水溶液滴定法,（三）应用示例：1.有机弱碱的测定:-咖啡因的含量测定 溶剂:醋酐-冰醋酸(5:1)终点颜色:黄色2.生物碱盐的测定:(1)氢卤酸盐:加醋酸汞冰醋酸溶液(2)硫酸盐:滴定至硫酸氢盐(3)硝酸盐:硝酸氧化性-破坏指示剂-电位法指示终点(4)磷酸盐与有机酸盐:直接滴定3.制剂的测定:非水滴定法一般用于生物碱的原料药的含量测定 制剂附加剂干扰,需预处理。,二、提取酸碱滴定法,生物碱制剂 其它组分干扰 提取分离 滴定含生物碱的中药及其制剂 为什么？怎么做？提取酸碱滴定法：利用生物碱及其盐类的溶解性质差异，经碱化、有机溶剂提取后，再用酸碱滴定的容量分析，适合于一些碱性较强（pKb=69）生物碱类药物的分析。,（一）原理和方法,提取分离 滴定 第一步 第二步1.碱化和提取分离 供试品 溶于水or稀矿酸+碱性试剂 有机溶剂振摇提取 有机相水洗 脱水(无水硫酸钠or西黄蓍胶)滤过 分得有机相,原理和方法,2.滴定(1)定量过量酸溶:有机溶剂蒸干 残渣 定量过量酸滴定液溶 碱滴定液回滴 若生物碱易挥发or分解 有机溶剂蒸至近干 先加入酸滴定液“固定”生物碱 继续加热除去残余的有机溶剂 放冷后滴定(2)中性乙醇溶:有机溶剂蒸干 残渣 少量中性乙醇溶解 酸滴定液滴定(3)直接酸提:不蒸有机溶剂+定量过量的酸滴定液 振摇 生物碱转入酸液中 有机层水洗 合并 碱滴定液回滴 注:有些生物碱(可待因、奎宁)盐酸盐溶于氯仿 氯仿为提取溶剂 酸滴定液不宜用盐酸，应选硫酸,（二）测定条件的选择,碱化试剂提取溶剂指示剂的选择乳化的预防和消除（三）应用示例磷酸可待因的含量测定：祥见讲义,1.碱化试剂,氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钙、氧化镁含酯结构的药物 分解含酚结构的药物 酚盐 强碱不适于含脂肪性共存物的药物 乳化氨水：常用的、理想的碱化试剂（pKb=4.76），一般的生物碱的pKb=69，足以使大部分生物碱游离；不会产生分解和乳化作用；氨具有挥发性，易除去，消除对测定的干扰。,2.提取溶剂,选择原则:(1)应选择对生物碱具有极大的溶解度又与水不相混溶的，对其他物质不溶或几乎不溶的易挥发性有机溶剂。(2)所选择的有机溶剂对生物碱及碱化试剂应化学惰性。（提取强生物碱时，不易用氯仿）常用溶剂：1.氯仿:最常用(除少数不溶于氯仿的生物碱如吗啡及强碱性生物碱)2.乙醚 3.氯仿+乙醚;氯仿+醇;二氯乙烷+二氯甲烷,3.指示剂的选择,生物碱 强酸滴定 强酸弱碱盐 终点溶液酸性 酸性区域指示剂,4.乳化的预防和消除,（1）预防：采用碱性弱的碱化试剂；选择不易产生乳化的有机溶剂；在提取完全的前提下，尽量避免剧烈的振摇。（2）消除：再加一些有机相或水相或放出已分层的有机相，通过改变相体积比破坏乳化层的稳定性。加数滴乙醇并轻轻转动分液漏斗。用热毛巾在分液漏斗外热敷。加入无机盐破坏乳化。用脱脂棉过滤。将乳化层离心，用离心力帮助乳化层分层。,三、酸性染料比色法,生物碱+酸性染料 一定pH 定量结合显色 测含量（磺酸酞类）方法的灵敏度较高，具一定的专属性和准确性 适合含量较低的生物碱制剂的定量分析应用示例：中国药典硫酸阿托品片的含量测定；氢溴酸山莨菪碱的片剂和注射液的含量测定对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；测定,（一）原理和方法,BH+In(BH+In)水相(BH+In)有机相 酸性染料 离子对化合物（电中性）(溴百里酚蓝、溴酚蓝、溴甲酚紫、溴甲酚绿)定量提取 一定，测吸收度 或碱化，释放酸性 染料，测吸收度 计算含量,（二）问题的讨论,提取化学平衡：BH+水相+In水相(BH+In)有机相 k=影响酸性染料比色法的关键因素：介质的pH值酸性染料的性质有机溶剂的性质,酸性染料比色法的影响因素,1.水相pH值的选择:B+H+BH+HIn H+In-pH过低,抑制酸性染料离解,In-浓度太低,影响离子对形成 pH过高,生物碱呈游离状态,不能形成离子对选择一个最佳pH值 酸性染料比色法至关重要的实验条件选择方法:根据生物碱和染料的pK值而定2.酸性染料的种类:选择要求:与生物碱定量结合;生成的离子对在有机相中溶解度大;在最大吸收波长处有较高的吸收度,酸性染料比色法的影响因素,3.有机溶剂的影响 有机溶剂与离子对形成氢键的能力强 提取效率高 氯仿、二氯甲烷 中等程度的提取率；选择性好 常用的有机溶剂4.水分的 影响：严防水分的混入 原因：微量水分会使有机溶剂发生混浊，影响比色；由水分带入未反应的染料，会使结果偏高。5.共存物的影响：赋形剂，中性、酸性以及极弱碱性的物质不干扰。强酸可改变染料溶液或缓冲液的pH，对测定有干扰。,（三）应用示例,中国药典硫酸阿托品片的含量测定1.对照品溶液的制备2.供试品溶液的制备 3.测定法:提取溶剂:氯仿 酸性染料:溴甲酚绿 测定波长:420nm 计算中国药典:氢溴酸山莨菪碱的片剂、注射液,四、高效液相色谱法,高效液相色谱法在生物碱含量测定中应用广泛，近二十年报道的生物碱类药物分析的文献中，HPLC法的数目居首位，其中80%以上采用反相高效液相色谱法。反相高效液相色谱法反相离子对高效液相色谱法其它高效液相色谱法,（一）反相高效液相色谱法,固定相：极性很弱，如ODS。流动相：极性较强，如水-甲醇、水-乙腈出峰顺序：极性强的组分先出峰，极性弱的组分后出峰。适用情况：适合于共存组分极性差异较大样品的分析。注意事项：防拖尾及保留时间过长 加入碱性试剂，使 pH为78左右 离子抑制HPLC 常用碱性试剂：二乙胺、三乙胺 例：中国药典（2000年版）甲磺酸二氢麦角碱片的含量测定,（二）反相离子对高效液相色谱法,离子对色谱法：将待测组分的反离子加入到流动相中，同呈离解状态的药物生成可逆的离子对化合物。分离生物碱类药物主要采用烷基磺酸盐（戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠）影响因素：pH值，反离子种类，流动相（流动相应呈酸性）。例：USP（23）测定硫酸吗啡和硫酸吗啡注射液。BP测定硫酸阿托品注射液含量祥见（P239）,（三）其它高效液相色谱方法,1.固定相：硅胶柱 以极性有机溶剂和水的混合溶液为流动相（分离机理 离子交换色谱）碱性药物离解，正离子与硅胶表面硅醇基上的H+交换。保留时间与药物的碱性有关，而与脂溶性关系不大，药物碱性越强，离解的比例越大，保留时间越长。流动相中加入一定量的醋酸铵，NH4+为竞争离子，与质子化的药物竞争硅胶表面的离子交换部位，起调节保留时间和改善分离的作用。,其它高效液相色谱方法,2.固定相：金刚烷基硅烷化硅胶 金刚烷(C10H16)刚性分子结构(体积大)掩蔽周围硅胶表面的游离硅醇基 改善分离3.固定相：ODS；流动相加入扫尾剂（三乙胺）扫尾剂：抑制或掩蔽固定相表面游离硅醇基的活性，使碱性药物易于出峰，且峰形对称。,五、气相色谱法,生物碱的游离碱 直接GC分析生物碱的盐 约325C的急速加热器中 解离 游离生物碱 酸（对色谱柱和检测器有不良影响）生物碱盐的水溶液盐应先碱化 有机溶剂提取 游离碱例：硫酸阿托品片剂的含量测定USP(23),