药物分析 第十四章 维生素类药物的分析.ppt

第十四章维生素类药物的分析,概 述,维生素维持正常生理功能所必需的、微量营养物质，人体不能合成维生素。必须从外界食物中摄取。,维生素的发现是20世纪的伟大发现之一。1897年,C.艾克曼在爪哇发现只吃精磨的白米即可患脚气病，未经碾磨的糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病的物质能用水或酒精提取,当时称这种物质为“水溶性B”。,Christiaan Eijkman1929 诺贝尔生物医学奖,The Discovery of Vitamin,发现简史,必需维生素 13种,维生素A，维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，维生素H（生物素），维生素P，维生素PP，维生素M，维生素T，维生素U，水溶性维生素。,分类,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,维生素A的简介,是鱼类肝脏中提取的一种不饱和脂肪醇，又称鱼肝油。目前主要采用人工合成。,在体内以视黄醇的形式储存，缺乏会影响视色素的合成，导致夜盲症，视力减退。,第一节 维生素A的分析,全反式,第一节 维生素A的分析,结构,共轭多烯醇侧链的环己烯,黄色棱形，62-64,淡黄色棱形，57-58,无定型，28-29,去氢维生素VitA2,去水维生素VitA3,易发生脱氢、脱水、聚合反应,第一节 维生素A的分析,溶解性:与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。不稳定性：含有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光裂解，特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。,第一节 维生素A的分析,性质,紫外吸收：共轭多烯醇侧链结构，在325-328nm之间有最大吸收，可用于鉴别。,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,天然维生素A主要是反式,CHCl3,可用于鉴别和含量测定,与三氯化锑呈色:三氯甲烷+三氯化锑=不稳定的蓝色,与三氯化锑呈色反应,第一节 维生素A的分析,鉴别实验,（一）Carr-Price反应,蓝色,紫红,第一节 维生素A的分析,条件：无水、无醇,SbCl3,水,SbOCl,乙醇可使碳正离子的正电荷消失,第一节 维生素A的分析,要求仪器和试剂必须干燥无水，三氯甲烷必须无醇,第一节 维生素A的分析,max为326nm一个吸收峰,max为350390nm三个吸收峰,五个共轭双键,六个共轭双键,最大吸收峰红移,（二）UV法,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,维生素A在无水乙醇溶液中溶解,立即进行UV扫描,在360nm处有一最大吸收峰.当盐酸水浴加热30s,迅速冷却,此过程发生脱水反应,扫描时出现三个吸收峰,USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值,BP 对照品法 显色剂 三氯化锑,（三）TLC法,第一节 维生素A的分析,展开剂：环己烷-乙醚（80：20）,均显蓝色斑点，维生素醇（Rf=0.1）维生素醋酸酯（Rf=0.45）维生素棕榈酸酯（Rf=0.7）,酸值,取乙醇与乙醚各15ml，置锥形瓶中，加酚酞指示剂5滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至显粉红色，再加本品2.0g，振摇使溶解，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，酸值应不大于2.0（附录VIIH）,杂质检查,过氧化值,取本品1.0g，加冰醋酸-三氯甲烷（6:4）30ml，振摇使溶解，加碘化钾的饱和溶液1ml，振摇1分钟，加水100ml与淀粉指示液1ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）不得过1.5ml。,杂质检查,第一节 维生素A的分析,含量测定,（一）UV法（三点校正法）,第一节 维生素A的分析,维生素A在325328nm的波长范围内有最大吸收，可用紫外法进行含量测定但维生素A原料常混有杂质如：,第一节 维生素A的分析,维生素A的氧化产物,第一节 维生素A的分析,维生素A在光照下产生的无活性的聚合物,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,测定对象：VitA醋酸酯时，ChP2015规定,第一法 等波长差法,第一节 维生素A的分析,第二法 等吸收比法,测定对象：VitA醇时，ChP2015规定,第一节 维生素A的分析,合成的或天然的维生素A 均为酯式维生素A，根据供试品中干扰杂质的多少，可采用：（1）直接测定法（2）皂化法,第一节 维生素A的分析,求,求效价,（1）基本步骤,A选择，A328测定或A328校正,求标示百分含量,（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯的测定）1）方法 取样品适量，精密称定，加环己烷溶解在300、316、328、340、360nm测吸收度，以确定最大吸收波长（A328或A328校正）。,第一节 维生素A的分析,b.判断法 最大吸收波长在326-329nm之间，且5个波长下的绝对值差值均不超过0.02时，可直接用328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。,a.计算吸收度比值（Ai/A328）：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。,第一节 维生素A的分析,最大吸收波长在326-329nm之间，计算5个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，应按以下的方法进行判断：,A328校正=3.52（2 A328 A316-A340）,第一节 维生素A的分析,（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯的测定）1）方法 取样品适量，精密称定，加环己烷溶解在300、316、328、340、360nm测吸收度，确定A2）计算 a.吸光系数E1%1cm,第一节 维生素A的分析,b.求效价（IU/g）：效价指每g供试品所含维生素的A的国际单位数。,第一节 维生素A的分析,1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯,IU/g=,第一节 维生素A的分析,每克纯品相当多少个单位（IU）?,1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,c.求维生素A占标示量的百分含量,AA328或A328校正D供试品的稀释倍数换算因子维生素A醋酸酯在环己烷中1900；维生素A醇在异丙醇中1830W为平均内容物重量；W为称取内容物重量（供试品取用量）L 比色池厚度标示量为处方中规定的每粒中所含的国际单位数,第一节 维生素A的分析,VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,第一节 维生素A的分析,A300：0.354A316：0.561A328：0.628A340：0.523A360：0.216,A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299,求本品中维生素A的含量？,第一节 维生素A的分析,A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+0.010.01 0+0.02+0.04,=,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,适用于维生素A醇,（等吸收比法）,第一法无法消除杂质干扰时用此法,皂化法、6/7A法,（2）第二法,第一节 维生素A的分析,水溶性,脂溶性,第一节 维生素A的分析,判断max是否在323327nm之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,第一节 维生素A的分析,判断 A300/A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,f,第一节 维生素A的分析,高效液相色谱法,流动相：正己烷异丙醇（9973）检测波长：325nm系统适用性实验考察分离度是否能将维生素A醋酸酯顺式和反式分开,第一节 维生素A的分析,三氯化锑比色法,max 618nm620nm,标准曲线法,第一节 维生素A的分析,优点：简便 快速,第一节 维生素A的分析,小结,维生素A共轭多烯醇侧链的环乙烯性质：脂溶性；不稳定，可与三氯化锑呈色鉴别：三氯化锑反应；UV；TLC含量测定：紫外-分光光度法（三点校正）三氯化锑比色法,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,维生素B1广泛分布于米糠、麦麸和酵母中，具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能。主要用于治疗维生素B1缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。,第一节 维生素B1的分析,氨基嘧啶环,噻唑环,亚甲基,氯化4-甲基-3(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基-5-（2-羟基乙基）噻唑鎓盐酸盐,结构与性质,维生素B1（盐酸硫胺）,第二节 维生素B1的分析,结构与性质,维生素B1为白色结晶或结晶性粉末易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚水溶液呈酸性,1.溶解性,性质,噻唑环、嘧啶环共轭双键12.5g/ml盐酸溶液（9 1000）,max=246nm,2.硫色素荧光反应,3.UV,杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。,4.与生物碱沉淀试剂反应,5.氯化物的特性,与NaOH共热，形成硫化钠，硝酸铅生成黑色沉淀；,6.硫元素反应,7.红外光谱特征,二、鉴别试验,（一）硫色素荧光反应为维生素B1所特有,H2O,溶于丁醇，显蓝色荧光,维生素B1,VitB1,H+,H+,H+,沉淀反应,H+,S元素反应,Cl-反应,硫元素反应和氯化物反应,H+,Company Logo,三、含量测定,高氯酸滴定液（0.1mol/L）的滴定度(T)为16.86mg/ml。喹那啶红亚甲蓝(紫红天蓝),非水溶液滴定法,紫外分光光度法,维生素B1分子中具有共轭双键，在紫外区有吸收,注意,维生素B1片的测定,片剂、注射剂,=421,（每片）相当于标示量的%=,A=ECL,ChP,1,1,（每ml）相当于标示量的,NaOH,硫色素荧光法：维生素B1的专属性反应,2.方法,小结,维生素B1（盐酸硫胺）氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成季铵盐。性质：水溶性；硫色素反应；可与生物碱沉淀剂反应鉴别：硫色素反应；沉淀反应；Cl、S反应含量测定：非水滴定；紫外分光光度法；硫色素荧光法,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,第三节 维生素C的分析,维生素C是胶原蛋白形成所必需的，有助于保持间质的完整，维生素C 缺乏可导致齿龈肿胀，出血，皮下瘀点，关节及肌肉疼痛，毛囊角化，严重缺乏可引起坏血病。所以维生素C又称为抗坏血酸。,L-抗坏血酸,(有生物活性),L-二酮古罗糖酸,L-去氢抗坏血酸,无生物活性,第三节 维生素C的分析,结构与性质,C3OH的pKa=4.17,C2OH的pKa=11.57,2.酸性,一元酸,性质,1.溶解性,易溶于水，水中呈酸性；略溶于乙醇，不溶于三氯甲烷或乙醚,L(+)抗坏血酸活性最强比旋度+20.5+21.5,手性C（C4、C5）,3.旋光性,*,*,含有四个光学异构体,有活性,有活性,无活性,4.还原性,二烯醇结构,与碱反应,5.水解反应,弱碱中生成单钠盐，强碱中水解,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,6.具糖的性质,五碳糖,维生素C,7.UV特征,维生素C具有共轭双键,利用还原性：与氧化剂的反应,鉴别试验,（一）与AgNO3反应,去氢抗坏血酸,黑色,（二）与2，6-二氯靛酚反应,氧化型,玫瑰红色（酸性）,蓝色(碱性),无色,与碱性酒石酸铜反应,与KMnO4反应,（三）与其他氧化剂反应,砖红色沉淀,试剂褪色,磷钼酸 钼蓝,与磷钼酸反应,（四）薄层色谱法,（五）糖类反应,H2O,维生素C可在三氯醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖，再失水，转化为糠醛，加入吡咯，加热至50 产生蓝色,0.01mol/L HCl,（五）紫外光谱法,BP2010,杂质检查,（一）溶液的澄清度与颜色检查,内酯环水解,糠醛缩合呈色,高于或低于,空气、光线、温度,维生素C,脱羧,控制有色杂质,维生素C,（二）铁、铜离子,（三）草酸的检查,草酸与金属离子作用形成沉淀；所以对Vc的原料，尤其是注射液，要进行草酸检查；加入CaCl2，比浊法；,原子吸收分光光度法,（二）铁、铜离子,原子吸收分光光度法,四、含量测定,维生素C,维生素C制剂,碘量法,二氯靛酚法,紫外分光光度法,高效液相色谱法,指示剂 淀粉指示液,（一）碘量法,原理：利用Vc强的还原性,HAc,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。,2、方法,原料药,（2）酸性环境 稀醋酸,（1）新沸冷H2O,减慢VitC被O2氧化速度,（3）立即滴定,赶走水中O2，,减少O2的干扰,3、注意事项,（4）附加剂干扰的排除,片剂 过滤,（二）2，6-二氯靛酚滴定法,快速滴定，专属性强，用于含Vit C的制剂与食品分析,自身指示终点,1.原理,2.方法,（2）快速滴定 2min内,（1）酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）亦可剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,3.注意事项,（4）二氯靛酚不稳定，须临用前配制并标定,专属性强，多用于含 Vc的制剂和食品的分析,配制方法：NaHCO3 42mg+水50 ml，加二氯靛酚钠二水合物0.5g+水200 ml,过滤，即得。标定方法：用干燥的维生素C对照品进行标定,（三）高效液相色谱法,人血浆中VitC浓度的HPLC法测定,小结,维生素C（L抗坏血酸）烯二醇结构性质：水溶性；酸性；旋光性；还原性；水解性 糖类性质；紫外吸收特性鉴别：硝酸银反应；二氯靛酚钠反应；氧化反应；TLC；糖类反应；紫外杂质检查：澄清度与颜色检查 铁、铜离子检查 草酸检查含量测定：碘量法；二氯靛酚滴定法；高效液相色谱,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,Sources,SunlightFoodsFortified MilkFish Oils,Deficiency,佝偻病牙齿松动鸡胸骨质疏松脚成弓形,Function,促进钙、磷的吸收；促进骨骼和牙齿的正常生长；调节柠檬酸的代谢,第四节 维生素D的分析,维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称，目前有10多种，都是甾醇衍生物。,维生素D2 维生素D3,第四节 维生素D的分析,维生素D2、D3无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。,溶解性:维生素D2在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚中易溶；维生素D3在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。不稳定性:毒性增强.含有多个烯键，所以极不稳定，宜氧化变质，效价降低，毒性增强。,第四节 维生素D的分析,旋光性:有五到六个手性碳原子,均具有旋光性.维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子,第四节 维生素D的分析,显色反应 甾类化合物氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色紫外吸收特性 无水乙醇 265nm 维生素D2 为460490 维生素D3 为465495,醋酐硫酸,E,1cm,1%,E,1%,1cm,二、鉴别试验,（一）显色反应,1与醋酐-浓硫酸反应,氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色,醋酐硫酸,2与三氯化锑反应,本品,1,2-二氯乙烷,三氯化锑试液,橙红色,粉红色,3其它显色反应,维生素D,三氯化铁,橙黄色,二氯丙醇 乙酰氯,绿色,（二）比旋度鉴别,无水乙醇溶液,维生素D2,比旋度为102.5至107.5,维生素D3,比旋度为105至112,（三）其它鉴别方法,薄层色谱法、HPLC法制备衍生物测熔点,紫外、红外吸收光谱,（四）维生素D2、D3的区别反应,维生素D2,维生素D3,96%乙醇,10ml,取0.1ml,乙醇1ml和85%硫酸5ml,红色max570nm,黄色 max495nm,三、杂质检查,（一）麦角甾醇的检查,维生素D290%乙醇溶液,洋地黄皂苷溶液,不得发生浑浊或沉淀,（二）前维生素D的光照产物,（三）有关物质检查,Ch.P 2010NP-HPLC,含量测定,USP34-NF29,化学法,色谱法,微生物法,BP2010,化学法,色谱法,光谱法,四、含量测定,正相高效液相色谱法,（一）维生素D测定法,含量以单位表示每单位相当于维生素D 0.025g,注意：计算的是维生素D及前维生素D经折 算成维生素D的总量,固定相：硅胶 流动相：正己烷正戊醇（997：3）检测波长：254nm,第一法：用于无维生素A醇及其他干扰的供试品第二法：(1)皂化提取;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受干扰时，采用此法。,小结,维生素D抗佝偻病维生素的总称性质：脂溶性；不稳定；旋光性；显色反应；紫外鉴别：显色反应；比旋度；VD2、VD3区别杂质检查：麦角甾醇；前维生素D光照产物；有关物质含量测定：三法,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,主要讲解,第五节 维生素E的分析,维生素E早在20世纪20年代就被人们发现，Evans和他的同事在研究生殖过程中发现，酸败的猪油可以引起大鼠的不孕症。是与生育有关的维生素的总称1936 年分离出结晶体1938 年被瑞士化学家人工合成,维生素E的显微照片,维生素E胶囊,维生素E类结构与相对活性,维生素E的结构,2R*(4R*,8R*)-3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-2H-苯并吡喃-6-醇醋酸酯,-生育酚醋酸酯,生物效价 右旋体：消旋体=1.4：10,（天然品）,（合成品）,维生素E的性质,性状:黄色或金黄色粘稠状透明液体脂溶性:溶于丙酮、乙醇、乙醚或植物油等有机溶剂中水溶性:不溶于水稳定性:无氧时对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，遇光可被氧化，色渐变深，,UV：乙醇溶液中max284nm,（一）,硝酸反应,二、鉴别试验,维生素E在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚,水解,三氯化铁联吡啶反应,（二）,生育酚,对-生育醌,红色,Fe3+,O,max=284nm,min=254nm,0.01%无水乙醇中,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷-乙醚（4：1）,显色剂 硫酸（105 5）,VitE Rf=0.7-生育酚 Rf=0.5-生育醌 Rf=0.9,维生素E合成过程,2,3,5-三甲基对二苯酚,植醇,+,-生育酚,-生育酚醋酸酯,三、杂质检查,三、杂质检查,（一）酸度,游离醋酸,（二）生育酚,硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄灰紫）,利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈,三、杂质检查,1.原理,2.试剂,问药典中规定的维生素E中所含的游离生育酚的限量是多少？,计算每ml硫酸铈滴定液（0.01mol/L）相当于0.002154g的游离生育酚,2.15,限量,(三)有关物质的检查,(四)残留溶剂：环己烷的检查,四、含量测定,GC法,（一）,GC特点,1、,选择性好灵敏度高速度快分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化。易受样品蒸气压限制,载气N2固定液硅酮（OV-17）担体硅藻土或高分子多孔小球柱温265检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标正三十二烷 n 500 R2,内标法加校正因子定量,2、VitE测定的色谱条件,内标法,供试液（样品+内标）,内标物,对照液（对照+内标）,是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近,样品 dl生育酚固定相十八烷基硅烷键合硅胶流动相甲醇-水（49：1）检测波长292nm R2.6 RSD0.8%,（二）HPLC法（外标法）,（三）荧光分光光度法,对照品 dl生育酚在220400nm波长范围内，以发射、激发波长间隔为40nm扫描同步荧光光谱，测定同步荧光峰的荧光强度信号值。,VE=,F样品,-,F空白,F标准,-,F空白,4.0（mg/L),第六节 复方制剂中多种维生素的分析,一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂二、反相HPLC法同时测定9种水溶性维生素三、非水反相HPLC法同时测定4种脂溶性维生素,练习与思考,A型题,1.维生素B1的鉴别方法是A.三氯化铁反应 B.硫色素反应 C.柯柏反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应 E.双缩脲反应,2.维生素E中国药典规定的含量 测定方法为A.非水溶液滴定法 B.旋光法 C.HPLC法 D.紫外分光法 E.GC法,B型题,A。亚硝基铁氰化钠反应 B.硫色素反应 C.硝酸反应 D.三氯化锑反应 E.硝酸银试液的反应 1.维生素C 2.维生素E 3.维生素B1 4.维生素A,E,C,B,D,X型题,1.用碘量法测定的药物有A.醋酸地塞米松 B.丙酸睾酮 C.维生素C D.硫酸阿托品 E.维生素C注射液,返 回,2.可用紫外分光光度法测定含量的 药物有A.维生素A丸剂 B.丙酸睾酮 C.维生素A D.硫酸阿托品 E.维生素B1片,简答题 简述碘量法测维生素C含量的原理及实验注意事项。,练习与思考,A型题,1.维生素B1的鉴别方法是A.三氯化铁反应 B.硫色素反应 C.柯柏反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应 E.双缩脲反应,2.维生素E中国药典规定的含量 测定方法为A.非水溶液滴定法 B.旋光法 C.HPLC法 D.紫外分光法 E.GC法,B型题,A。亚硝基铁氰化钠反应 B.硫色素反应 C.硝酸反应 D.三氯化锑反应 E.硝酸银试液的反应 1.维生素C 2.维生素E 3.维生素B1 4.维生素A,E,C,B,D,X型题,1.用碘量法测定的药物有A.醋酸地塞米松 B.丙酸睾酮 C.维生素C D.硫酸阿托品 E.维生素C注射液,返 回,2.可用紫外分光光度法测定含量的 药物有A.维生素A丸剂 B.丙酸睾酮 C.维生素A D.硫酸阿托品 E.维生素B1片,简答题 简述碘量法测维生素C含量的原理及实验注意事项。,