荧光细胞化学样品制备和检测技术.ppt

荧光细胞化学样品制备和检测技术,蔡司光学仪器,什么是显微镜荧光检测？,一般荧光显微镜荧光观察，是借标本:1）本身的荧光反应物质吸收荧光光源发出的激发光能而呈现的荧光现象，或2）利用组织及细胞内某成分可与荧光染料（荧光色素）结合并受到荧光激发后所出现特定颜色的荧光供作观察。作出定性、定位（根据荧光图象的形态学特征和颜色）和定量（根据荧光的亮度）。其中：1）为自发荧光，2）为继发荧光。,落射荧光与透射光观察的区别,落射荧光与透射光观察的区别,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发光化荧光,荧光的性质,吸收光，必需有激发光源荧光波长激发波长（损失热能）荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光显微镜的优点和用途,优点：检出能力高（放大作用）对细胞的刺激小（可以活体染色）能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光素荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体荧光等发荧光量的测定对物质定性、定量分析,标本制作的顺序,组织固定、取材、组织脱水、包埋、切片、染色、封片培养的悬浮细胞、粘附细胞,组织固定,活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织学改变，并导致形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态改变直至腐败自溶。选择最佳固定液标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。,单纯固定液,（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。甲醛（40%）100ml无水磷酸氢二钠 6.5g磷酸二氢钠 4.0g 蒸馏水 900ml,单纯固定剂,（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。,混合固定液,（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。甲醛（40%）100ml95%乙醇 900ml（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。无水醋酸钠 1.25g升汞 6.0g蒸馏水 90ml使用前加入甲醛 10ml,混合固定液,（3）Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。饱和苦味酸水溶液（约1.22%）75ml甲醛 25ml冰醋酸 5ml（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。无水乙醇 60ml氯仿 30ml冰醋酸 10ml,混合固定液,（5）Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较高且需特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。升汞 5.0g重铬酸钾 2.5g硫酸钠 1.0g蒸馏水（加至）100ml,取材,组织取材：按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。细胞标本的取材（1）贴壁生长的培养细胞（2）悬浮的培养细胞：沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin），载玻片上涂粘附剂多聚赖氨酸（0.010.5%），甲醛-明胶，铬矾明胶，Vectabond试剂（3）体液沉淀涂片法（4）穿刺吸取涂片法（5）印片法,组织脱水,包埋,组织块经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理后，用包埋剂（如石蜡、树脂、塑料等）将其包制成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。包埋步骤先将熔化的石蜡注入包埋托内，而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台商，用镊子轻按组织块，以达到组织块平整，盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同，选择大小型号合适的包埋托；有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻，以使组织组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求。,切片,冰冻切片为免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的组织及已经固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如果不染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存于冰箱中保存。要注意刀片等接触阳性物质的污染问题。,切片,石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄片），组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组织化学技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的温度下进行。脱水、透明等过程应在4下进行，以尽量减少组织抗原的损失；组织块大小应限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸腊；浸腊、包埋过程中，石蜡应该保持在60以下，以熔点低的软腊最好（低温石蜡包埋）；石蜡切片应放在37恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可存放于4冰箱内备用；冷冻干燥包埋法：可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。,切片,振动切片 可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成20100um的厚片，以漂浮法进行染色。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能比较好地保留组织细胞内脂溶性物质和细胞膜抗原。,封片,封片剂常用甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液。如需将染色后的样品保存一段时间，可以用指甲油在盖玻片周围封闭。暗处保存。一般无须脱水透明以及用树胶封片。如果必须脱水透明，封片最好用DPX。由于激光共聚焦显微镜观察采集图象很快，所以一般用PBS或生理盐水也可以。,组织和细胞的自发性荧光检测,1、动物组织一般呈现弱淡兰色荧光，其中弹性纤维的荧光较强；2、红细胞血红蛋白中的卟啉呈红色荧光，但在正常情况下，卟啉和铁离子相结合，铁离子有抑制荧光作用，所以红细胞不发荧光。如在血液中加酸使铁离子游离，或缺铁性贫血，红细胞可呈红色荧光；3、细胞内的脂褐素呈棕黄色的自发荧光，例如心肌细胞核两侧的肌浆内，随着年龄的增长或在某些疾病的情况下，可见较大量的棕黄色脂褐素荧光颗粒；4、某些肿瘤细胞在紫外或蓝光激发可呈现明显的自发荧光，可作原位肿瘤的早期诊断；5、维生素A呈绿色的自发性荧光。如大鼠食入维生素A后，在肝细胞、Kuffer细胞、肾上腺束状带细胞、肺和肾的间质细胞、卵巢间质细胞和黄体细胞等的胞质内均可见到维生素A的绿色荧光；6、某些药物也可呈现一定颜色荧光，如奎宁为绿色荧光，四环素为黄色荧光。四环素能与骨基质中的钙结合，利用这一特性，可以用四环素饲养动物以观察新骨质的形成。另外，四环素和癌细胞有较大的亲合力，能在恶性肿瘤内形成黄色的荧光灶；7、有机体的单胺神经原、消化道和呼吸道粘膜内神经内分泌细胞中的内源性生物胺儿茶酚胺、5-羟色胺和组织胺等与某些醛类物质在一定条件下可发生缩合反应而呈现荧光。,荧光组织细胞染色（荧光探针检测，荧光标记检测）,荧光染色方法,浸染（组织或细胞固定在玻片上浸入染色缸，悬浮细胞在悬液中染色，再涂于玻片上），适用于染液较多，样品在玻片上固定比较牢固，染色时间需要比较长，染色均匀。滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的组织或细胞上），适用于染液较少，样品在玻片上固定不是很牢固，染色时间较短。染色不易均匀，特别是时间比较长时，需添加染料。漂浮法（组织片或培养黏附在一些膜上的组织细胞漂浮于染液上），适用于较大较厚的组织片，或黏附在一些膜上的组织细胞，染料使用相对较少。由于样品一般是反过来面朝下（染液面），所以特别注意不要在样品与染液间出现气泡。,细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色：,用FITC或Rhodamine标记的Phalloidin（鬼笔环肽）。F-肌动蛋白是大多数真核细胞中以聚合丝形式存在的肌动蛋白。Phalloidin能与细胞内的F-actin特异性结合。激发光激发Phalloidin上结合的荧光标记，使F-肌动蛋白被观察到。FITC或Rhodamine标记的Phalloidin，溶于甲醇中制成贮存液（200u/ml），染色时终浓度为5u/ml。细胞涂片 PBS洗涤 2%戊二醛固定15分钟 PBS洗涤 0.2%Triton X-100抽提2分钟 PBS洗涤 FITC或Rhodamine标记的Phalloidin室温20分钟 PBS洗涤，观察。,Fluorochromes and Stains,DAPI,Hoechst,SYTO 16:semipermeant and permeant DNA stain,apoptosisGFP:used in living systems as a gene/protein reporterLucifer yellow,Fluorogold:neuronal tracerMitoFluor green,MitoTracker green:mitichondrial marker,DiI:lipophilic membrane markerRhodamine 6G,MitoTracker red:mitochondrial and ER markerPropidium iodide,Ethidium Bromide,SYTO 25:impermeant and permeant nucleic acid stain,TO-PRO-3,Alexa 488,Alexa 568,Human colon cryptChristine Anderson,Laboratory of Prof.Ray White,Hunstsman Cancer Institute,Utah,细胞荧光离子探针,游离钙离子含量测定：有Fura 2 AM,Indo 1和Fluo 3AM,前两者激发波长为紫外，而且均是双激发波长的比率荧光，所以目前一般在荧光显微镜观察，特别是激光共聚焦显微镜观察中用Fluo 3AM。Ex/Em:506/526。Fluo 3本身不发荧光，只有当与胞浆内游离钙离子结合后，受激发光照射才发出荧光。Fluo 3AM不能与游离钙离子结合，但它能穿过细胞膜进入细胞内（Fluo 3 不能透过细胞膜进入细胞），进入细胞后的Fluo 3AM中的AM被细胞内非特异性酯酶水解，变为Fluo 3，Fluo 3与细胞内游离钙离子结合，发出荧光。荧光强弱直接反应了细胞内钙离子 的含量。Fluo 3AM 染色：Fluo 3AM用DMSO配成贮存液，冰冻保存，使用时终浓度为1uM。染色一般为37，3045分钟。Fluo 3染色细胞内钙离子，可以通过时间扫描，进行细胞内钙离子含量和分布的动态观察。细胞内pH的测定：SNAFL：双发射波长比率荧光。Ex:514(488),Em:580/640BCECF：双激发波长比率荧光。Ex:490/440,Em:530,Physiology Probes,Indo-1,Fura-2:dual emission or dual excitation calcium probeCalcium green,Fluo-3:single wavelength calcium probeBCECF:single or dual excitation wavelength pH probeJC-1:potential sensitive mitochondrial dual emissionCalcein:volume changes,gap junctions,liposomes,permeabilityLysosensor Blue DND-192,LysoSensor Green DND-153:lysosomal markerNBD-C6 ceramide:Golgi markerRhodamine-123:mitochondrial marker,SNARF:pH indicator emission ratioFM1-43,RH-414:plasma membraneFura red:calcium indicator,decreased fluorescence on bindingDIC18(3),DIC16(3):ER markerLysoTracker Yellow DND-68:lysosomal markerMitoTracker Orange,Rhodamine B Hexyl ester,Tetramethylrosamine:mitochondrial marker,Mouse;hippocampal neurons;fluorescence of GFPShigeo OkabeDepartment of Anatomy and Cell BiologyTokyo Medical and Dental University,免疫荧光细胞化学技术,根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。荧光抗体法：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。（较常用）荧光抗原法：用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。免疫荧光细胞化学标记的荧光素以异硫氰酸荧光素（FITC绿色荧光）、罗丹明（TRITC橙红色荧光）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC橙红色荧光），Cy3（橙红色荧光），Cy5（红色荧光），德克萨斯红（橙红色荧光）较常用。,免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法四种。,1、直接法：1）检查抗原法：（最早的方法）用已知的特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。该方法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。2）检查抗体法：将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。,2、间接法：1）检查抗体法（夹心法）先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间。2）检查抗体法用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待测血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。,3）检查抗原法双薄片先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（第二抗体，有种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合35个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35个分子的荧光抗体，所以与直接法相比荧光亮度可增强34倍。灵敏度高，只需制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。是目前使用得最广泛的技术。缺点为容易出现非特异性染色反应。,3、补体法1）直接检查组织内免疫复合物法用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物 抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物存在处，此法常用于肾穿刺组织活检等。2）间接检查组织内抗原法常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体抗补体荧光抗体的复合物。此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。缺点为容易出现非特异性染色反应。,4、双（多）重免疫荧光标记法在同一细胞组织标本上需同时检查两种或两种以上抗原时，要进行双（多）重荧光染色。一般均采用直接法。将这些荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上（也可分别加），孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体。不同荧光标记抗体最好用波长范围分得比较开的荧光素。如绿色与红色搭配。,研究中常用荧光染料和探针,细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免役荧光标记：与抗体耦联,直标:一抗+荧光探针 间标:二抗+荧光探针 如:微管蛋白tublin(抗 tublin抗体+荧光探针)肌动蛋白actin(Palloidine+荧光探针)1染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价的荧光抗体，在室温或37染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。2洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。3用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.09.5）甘油封固、镜检,研究中常用荧光染料和探针,细胞膜表面受体配体+荧光探针 如:nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)标记 Gm1:霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC1.切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。2.再滴加间接荧光抗体，染色30min，37，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。,研究中常用荧光染料和探针,1.Amine-Reactive Probes 与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690(异硫氰基荧光素)(四甲基异硫氰基罗丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578(藻红蛋白)Texas Red 595/615(德州红)Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618,研究中常用荧光染料和探针,2.标记细胞器荧光探针1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534，可染活细胞，阳离子,可检 测线粒体膜电位,且在多数细胞中停留 时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最 佳探针Mitotracker Green FM 490/516,染活细胞或固定细胞,稳定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576,(氧化型)Mitotracker Orange 还原型,只能染活细胞,研究中常用荧光染料和探针,2)溶酶体 Lysosome 中性红 541/640:微偏碱性,可标记溶酶体等酸性器官 为非特异性 AO:LysoTracker Green DND-26 504/511,染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500:非特异性,较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体4)高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536,可染活或死细胞,研究中常用荧光染料和探针,细胞器的单克隆抗体5)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死细胞碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活细胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活细胞 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死细胞SYTO1116 2024 488/520 活细胞SYTO1116 2024 521/556 活细胞SYTO 17 621/634 活细胞SYTO 25 521/556 Nucleic acid 活细胞POPO-3 534/570 DNA 死细胞,3.GFP 绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。将外源基因与GFP DNA 相连,GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.,研究中常用荧光染料和探针,研究中常用荧光染料和探针,GFP主要应用:对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达,如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程,