荧光显微成像技术和应用.ppt

荧光显微技术和应用,12级生物科学邱修明,原理,普通光学显微镜 通过普通光源的照明观察标本,荧光显微镜(fluorescence microscope)：利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)，用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位置。,荧光显微镜的种类,透射式,落射式,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,透射荧光显微镜原理图,标本,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,落射荧光显微镜原理图,透射式汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜,落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜,荧光显微镜的主要部件,分色镜 反射激发光，透过荧光暗场聚光镜 来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的,荧光图像的记录方法,荧光显微镜所看到的荧光图像具有：形态学特征和荧光的颜色、亮度判断结果时，必须将二者结合起来综合判断 记录结果：主观指标（即工作者目力观察）客观指标（细胞分光光度计、图像分析仪等）,荧光显微镜应用技术,1.对细胞结构或组分的定性位、半定量研究 免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技(directimmunofluorescent technique)”。用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。,由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位,2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。绿色荧光蛋白 绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛用途，包括有,1.分子标记 利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察,2.药物筛选 荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针,谢 谢,