荧光定量原理与分析方法08年.ppt
TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD,荧光定量原理与分析方法,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介SYBR法实验流程及注意事项,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时荧光定量PCR原理定义,扩增曲线 荧光阈值 Ct值,实时荧光定量PCR原理常用名词概念,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Logliner phase,Logliner phase,实时荧光定量PCR原理什么是扩增曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Logliner phase,Logliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过域值,Threshold,实时荧光定量PCR原理什么是荧光域值,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,C(t)value,实时荧光定量PCR原理什么是Ct值,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性,实时荧光定量PCR原理 Ct值的重现性,理想的PCR反应,XnX0 2n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0：起始模板数量,n：扩增循环数,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,非理想的PCR反应,XnX0（1En）n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0：起始模板数量,n：扩增循环数,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,在扩增产物达到荧光阈值时,XCtX0（1En）CtM（1）,*,XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M,方程式（1）两边同取对数得：,LogMLogX0*（1En）Ct（2）,整理方程式（2）：,LogX0 Log M CtLog（1En）,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Log of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系,LogX0 Log M CtLog（1En）,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介SYBR法实验流程及注意事项,实时荧光定量PCR的分类,不同的荧光标记方法不同的应用目的,特异性荧光标记：1.TaqMan 2.Molecular Beacon非特异性荧光标记：3.SYBR Green,实时荧光定量PCR的分类常用荧光标记方法,1、TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,实时荧光定量PCR的分类,实时荧光定量PCR的分类TaqMan法的工作原理,每扩增一条DNA分子释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,实时荧光定量PCR的分类,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同,TaqMan 法PCR反应的建立,对目标序列的高特异性 阴性结果确定 设计相对简单 与目标序列某一区域互补 重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针,缺 点,实时荧光定量PCR的分类Taqman法优缺点,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,2、分子信标(Molecular Beacon),实时荧光定量PCR的分类,实时荧光定量PCR的分类,分子信标工作原理,3、SYBR Green 法,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光,实时荧光定量PCR的分类,实时荧光定量PCR的分类SYBR Green 染料,SYBR Green 结合到DNA小沟部位示意图,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),实时荧光定量PCR的分类,原始图谱,对数图谱,SYBR Green法融解曲线定义,实时荧光定量PCR的分类,SYBR Green法融解曲线分析,容易与非特异性双链DNA结 合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高,缺 点,实时荧光定量PCR的分类SYBR方法的优缺点,实时荧光定量PCR的分类几种方法的比较,实时荧光定量PCR的分类,不同的荧光标记方法不同的应用目的,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等,实时荧光定量PCR技术的应用,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介SYBR法实验流程及注意事项,Sample,绝对定量分析方法简介绝对定量定义,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较,标准品的一些标准：必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量）标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数）在每组实验时，必需用相同的阈值设定来确定Ct值,绝对定量分析方法简介绝对定量的标准品,绝对定量分析方法简介标准样品的制备,拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v,绝对定量分析方法简介,乙肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）目录号（FP203）设置对照：浓度为106、105、104、103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,绝对定量分析方法简介举例1,绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行,Sample:HBV阳性标准品，分别含有5103、5104、5105、5106 copies/ml,实验数据：,绝对定量分析方法简介举例2,扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率=10-1/-3.17=2.03 E%=(2.03-1)100%=103%,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,y=-3.17x+37.52 R2=0.9988,绝对定量分析方法简介举例2,如未知样本Ct为20.5,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,将Ct值带入线性方程：,20.5=-3.1726 X+37.52,X=,-3.1726,=5.36,QuantityUnknown=105.36=229087 copies,y=-3.17x+37.52 R2=0.9988,绝对定量分析方法简介举例2,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介SYBR法实验流程及注意事项,相对定量分析方法简介为什么要用相对定量,模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等 RNA制备：RNA纯化得率、均一性等 反转录：反转录的效率等,相对定量分析方法简介内参照,GAPDHBeta-actinbeta-2-microglobulin(B2M)ribosomal protein L13a(RPL13A)PPIA(Cyclophilin)ubiquitin C(UBC)eukaryotic translation initiation factors 4A(eIF4A)18S rRNA,方法：双标准曲线法 2 Ct,相对定量分析方法简介几种不同的相对定量方法,对照样品目的基因浓度,待测样品参照基因浓度,优点：分析简单，实验优化简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,F=,待测样品目的基因浓度,对照样品参照基因浓度,公式：,相对定量分析方法简介双标准曲线法,相对定量分析方法简介Ct法：,公式：优点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可要求：标准曲线斜率差值0.1缺点：假定扩增效率为 100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,1816,1717.4,1.951.95,2-Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100，且相对偏差不超过5,Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）5.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍,修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的或增效率，但扩增效率不等于2，那么2Ct可以修正为：ECt，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95Ct,相对定量分析方法简介 Ct法举例,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介SYBR法实验流程及注意事项,SYBR法实验流程及注意事项,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器介绍,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,样品制备,环境要求,模板准备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,RT,反应体系优化,试剂选择,样品制备,模板准备,数据分析,上机,SYBR法实验流程及注意事项,模板准备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,反应体系优化,上机,反应条件优化,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,技能要求,误差控制,仪器介绍,上机,试剂选择,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005PTM,LINE-GENE FQD-66A,ABI PRISM 7500,iQ5 Real-Time PCR Detection System,数据分析,仪器介绍,分析方法,上机,RT,样品制备,模板准备,相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR法实验流程及注意事项,SYBR法理想实验结果梯度稀释扩增曲线,梯度稀释扩增曲线,SYBR法理想实验结果梯度稀释标准曲线,Y=-3.37x+36.33;R2=0.992,梯度稀释标准曲线,SYBR法理想实验结果熔解曲线,梯度稀释熔解曲线,SYBR法理想实验结果样本扩增曲线,JUN,GAPDH,理想实验结果样本熔解曲线,GAPDH,JUN,TIANGEN公司荧光产品,SYBR法,探针法,FP203 RealMasterMix(Probe),以DNA为模板,FP202 RealMasterMix（SYBR Green）,以RNA为模板,FP302 Quant qRT-PCR(SYBR Green),FP303 Quant One Step qRT-PCR(SYBR Green),TIANGEN公司荧光产品特点,试剂盒中使用改良后的Hotmaster Taq Polymerase，具有高效率、高灵敏度、高特异性特点多种不同的实验缓冲液，满足不同实验需求高效的Quant系列逆转录酶，满足RT需求独特的Mg2自动调节，随时保证为PCR提供最佳 Mg2浓度,谢谢！,
