荧光定量PCR检测技术.ppt

荧光定量PCR检测技术,（FQ-PCR,Fluorescence quantitative PCR）,实时荧光定量PCR技术,所谓real-time FQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法。PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性,实时荧光定量PCR,定义利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控目的对起始模板进行定量优点 灵敏，重复性，动态范围宽，高通量原理 Ct 值与起始模板浓度的对数成比例,实时荧光定量PCR原理,PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。,利用电泳定量,11,500 counts/5200 counts=2.2 fold difference,实时荧光定量PCR原理,在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。,实时荧光定量PCR原理,在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。,实时荧光定量PCR原理,为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值（threshold）。以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。threshold=10 SDcycle 6-15,实时荧光定量PCR原理,如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。,什么是C(t)值,C(t),Threshold（域值）,为什么要引入C(t)值,96 replicates of B7 gene molecular beacon,实时荧光定量PCR原理,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。,实时荧光定量,Ct 18 and Ct 22,2(4 Ct shift)=16 fold difference,实时荧光定量PCR原理,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,如何定量,标 准 曲 线,未知样品的C(t)值,定量,荧光化学,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料,一、TaqMan检测技术原理,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相同或互补，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,TaqMan检测技术原理示意图,PCR扩增前PCR扩增时,上游引物,完好探针,DNA合成,荧光物质,荧光淬灭物质,探针水解，释放荧光,模板负链,TaqMan 探针,未结合的探针,探针、引物与目的片段结合，FRET,光发射或者以热量形式散失,Donor dye(Reporter),Acceptor dye(Quencher),Light,Energy transfer,Taq,TaqMan检测技术的设计,与普通PCR的设计基本相同，区别在于引物与探针的设计一般需要特定的软件，如美国ABI公司开发的Primer Express软件。,（一）选择靶基因,TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如：某种病原微生物所共有的保守基因（检测某种病原微生物）；某个血清型所特有的基因序列（区分检测某个血清型）；选择决定毒力强弱的基因（区分强毒和弱毒）等。,（二）选择探针,选择探针需要同时满足以下条件：1、在靶基因的保守区域2、G+C含量在40%以上；3、相同碱基连续不超过4个；4、Tm值在712;,（二）选择探针,5、内部自身配对较少；6、5端不为G；7、G数目比C数目少；如果6和7难以满足的时候，就要考虑用互补序列作探针。,（三）选择引物,探针选好之后，在探针的上下游分别选择合适的引物序列，引物应满足如下的条件:1、在靶基因保守和无二级结构的区域；2、与探针所在区域不重叠；,（三）选择引物,3、与靶基因其他区域配对较少；4、G+C含量在40%以上；5、相同碱基连续不超过4个；6、Tm值比探针Tm值低101;,（三）选择引物,7、探针与两条引物之间的各种组合形成的二聚体都较少，特别是引物3端与探针配对很少；8、PCR扩增片断在70250个碱基之间。如果找不到合适的引物，可调整探针（向前或向后）的序列，或重新选择一个探针，再寻找合适的引物。,普通PCR临床检测技术的缺点,普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。,1、采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染，避免了假阳性。,FQ-PCR与普通PCR的区别,2、探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。A、上下游引物和探针三道关卡控制其特异性；B、引物和探针都比较长，退火温度较高，非特异性扩增几率减少。,FQ-PCR与普通PCR的区别,3、可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。,FQ-PCR与普通PCR的区别,FQ-PCR与普通PCR的区别,4、光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。能够实时检测，即一边PCR，一边检测PCR的结果，而不需要在PCR结束之后进行核酸电泳来显示PCR反应的结果，（因此实时荧光PCR检测技术操作更简单；也避免了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核酸污染等严重问题）；,FQ-PCR与普通PCR的区别,5、可以多重检测。如果检测两种以上的基因片断，可以对各个基因分别设计探针和引物，在不同的反应管中进行TaqMan检测，或者将各自的探针分别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系中检测多个基因片断。,二、SYBR荧光染料原理,在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,ssDNA=free dye(weak fluorophore),dsDNA=Binds minor groove(intense fluorophore),SYBR Green I(双链DNA结合染料),人医现所开展的检测项目,乙肝病毒（HBV）荧光定量PCR检测 丙肝病毒（HCV）荧光定量PCR检测淋球菌（NG）荧光定量PCR检测沙眼衣原体（CT）荧光定量PCR检测解脲支原体（UU）荧光定量PCR检测结核分支杆菌（TB）荧光定量PCR检测,兽医现所开展的检测项目,禽流感病毒（ALV）荧光定量PCR检测 新城疫病毒（NDV）荧光定量PCR检测蓝耳病病毒（PRRSV）荧光定量PCR检测,