荧光定量PCR技术临床应用.ppt
荧光定量PCR技术在临床医学研究中的应用及注意事项,内 容 提 要,一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用三、荧光探针定量PCR在临床医学中的主要问题,基因诊断的物质基础及与其它诊断方法的区别,基因诊断,免疫学诊断,临床诊断,细胞膜,细胞核,DNA,转录,mRNA,翻译,蛋白质,临床表现,生化诊断,临床实验医学发展,三个时代 标志技术 性质生化诊断时代 生化分析 表象免疫学诊断时代 酶免、放免 表象分子(基因)诊断时代 基因体外扩增(PCR)本质,1、病原体的定量检测及药物疗效考评（HBV）2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测（P53）3、遗传病基因的检测（地中海贫血）4、与疾病相关的各种蛋白质的基因表达的定量检测6、建立病原体的分子诊断标准,荧光定量PCR在临床医学中的应用,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一、肝炎病毒定量检测二、性病病原体检测三、优生优育相关项目检测四、结核杆菌及呼吸道病原体检测五、其他病原体检测,病毒性肝炎概况,病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组传染病。按病毒的生物学特征、临床和流行病学特征，1989年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后还报道了己（F）型和庚（G）型。我国是个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅乙型肝炎病毒感染者就达1.2亿，每年新增加的感染者也在百万以上，丙肝发病率亦趋上升。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，部分将会发展为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。,HBV基因型与血清型关系及流行病学分布,病原学,乙型肝炎检测标志物,HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA,乙型肝炎免疫检测和PCR结果异同,“大三阳”PCR结果阴性抗-HBs阳性，PCR结果阳性,荧光定量PCR技术对性传播疾病的检测,一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原体、解脲脲原体（CT、UU）(有证）三、梅毒螺旋体（TP）四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（HPV）（有证）六、人类免疫缺陷病毒（HIV）,PCR技术对性传播疾病检测的注意事项,1标本的选取 TP HSV 2临床疗效考评,超高倍,荧光定量PCR诊断TORCH综合征,传统的TORCH病原体：TOX,other,RV,CMV,HSV新近发现的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘带状 庖疹V、肠道V、乙肝V、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、人微小病毒B19等,TORCH感染的实验室诊断,一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断：IgG：IgM：1、不能定量分析 2、抗体的产生受多种因素的影响 3、产生假阳性三、基因诊断方法 原理：检测TORCH病原体的核酸 优点：1、客观指标 2、敏感性、特异性高 3、定量指标 荧光定量PCR在TORCH诊断中的应用：1、筛选TORCH的患者 2、建立TORCH的分子诊断标准,荧光定量PCR技术检测TOX,孕妇TOX感染的危害 孕早期（3月）25%感染胎儿，后期65%感染胎儿 但早期感染危害严重易感人群 1、吃生或未熟的含有囊虫或囊虫卵的肉类 2、从事动物尸体、皮毛等工作孕妇 3、饲养宠物，如猫、狗者,荧光定量PCR技术检测HCMV,人群自然感染率达到6080%，可通过胎盘、产道、母乳传染初次感染HCMV的孕妇传染胎儿的危险性1550%再次感染仅为0.5%2.5%,注意事项,缺乏分子诊断标准辅助指标,荧光定量PCR技术检测21三体综合征,孕妇外周血中有胎儿的少量细胞 通过PCR技术检测孕妇外周血中的胎儿细胞,荧光定量PCR技术用于性别鉴定,荧光定量PCR检测SRY基因 SRY基因，雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段 科研应用不提供商业试剂,EB病毒载量与鼻咽癌,血浆EBV载量与鼻咽癌显著相关 鼻咽癌病人血浆EBV与肿瘤复发相关 10个复发病人：32，250copies/ml 15个二年持续缓解病人：0 copies/ml 17个随访病人：临床恶化前6月显著升高,荧光定量PCR技术用于肺部感染的诊断,一、肺炎支原体的检测二、结核杆菌的检测意义：1、快速诊断 2、治疗方案与细菌感染的治疗方案 不同,地中海贫血,海洋性贫血又称地中海贫血（Thalassemia）。是一组遗传性溶血性贫血。其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成。导致血红蛋白的组成成分改变，本组疾病的临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性贫血本病以地中海沿岸国家和东南亚各国多见，我国长江以南各省均有报道，以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高，在北方较为少见,病因和发病机制,本病是由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致。组成珠蛋白的肽链有4种，即、链地中海贫血 大多数地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失所致地中海贫血 地中海贫血的发生主要是由于基因的点突变,白血病,白血病是一类常见的造血系统恶性疾病。特点为白细胞及其前身幼稚细胞在骨髓或其他造血组织中弥漫性地异常增生，进而浸润人体组织器官，产生各种症状急性白血病的分型1.急性非淋巴细胞白血病M1（急性粒细胞白血病未分化型）M2（急性粒细胞白血病部分分化型）M3（急性早幼粒细胞白血病）M4（急性粒一单核细胞白血病）M4Eo（伴嗜酸性粒细胞增多的粒一单核细胞白血病）M5（急性单核细胞白血病）M6（急性红白细胞）M7（急性巨核细胞性白血病）2.急性淋巴细胞白血病共分3型。L1L2L3慢性白血病的分型慢性髓系白血病慢性髓细胞白血病 慢性嗜中性粒细胞白血病 慢性嗜酸性粒细胞白血病2.慢性淋巴细胞白血病,融合基因,（1）BCR/ABL-P210，BCR/ABL-P190（2）PML/RARa-L，PML/RARa-S（3）ETO/AML（4）MLL/AF4（5）TEL/AML1（6）PBX1/EA2（7）CBFB-MYH11（8）HOX-11L2（9）SIL-TAL1 急性淋巴细胞性白血病 TEL/AML1急性粒细胞白血病 ETO/AML急性早幼粒细胞白血病PML-RARa慢性粒细胞白血病 BCR-ABL,TBP内参,内参即是内部参照可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正,临床PCR检验注意的问题,临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法,标本采集,标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染,临床标本的处理和保存,血清（浆）全血外周血单个核细胞痰棉拭子脓液体液乳汁组织,血清（浆）,DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（12周）保存可在-20下，较长期保存应在-70下,全血,以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测,可4下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA,外周血单个核细胞,外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70下,痰,痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液化如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下,棉拭子,在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置510分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,则需保存于-70下.,脓液,脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗23次后,即可用于DNA提取对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。沉淀标本的保存条件同样为-70,体液,临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。,乳汁,乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。提取方法：乳汁标本置4冰箱过夜取100ul中清液 10000rpm/min离心10分钟尽可能去除奶酪（建议用棉签蘸去）弃上清加50ulDNA提取液沸水浴10分钟10000rpm/min离心5分钟取5ul上清点样扩增。,组织,组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4可保存6年。石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取,临床标本中PCR反应抑制物,内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。外源性的:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。,常见的核酸提取方法,RNA提取的独特性,临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。,RNA提取所用器皿的处理,经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。,RNA提取所用溶液的准备,对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话,溶液均应用0.1%DEPC于37至少处理12小时,然后于100加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟。须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液。,RNA提取中RNase 污染的控制,实验操作人员的头发、唾液、手是RNase污染最主要的潜在来源。策略是：在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴一次性帽子、口罩和手套。在RNA提取实验中，应勤换手套。,荧光定量PCR技术检测的报告形式,定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原体的数量成正相关。一般来说细菌是多拷贝的，病毒是单拷贝的。DNA拷贝数单位和质量单位：100拷贝HBV0.04fg国际单位IU,拷贝数/ml的确定：,DNA/RNA 参考品（质粒等）,测量OD260的值得到mg/ml,通过与分子量的计算，得到拷贝数/ml,不同实验室得到的结果差别很大。,HCV国际单位与拷贝数换算,NGI SuperQuant:1 IU/mL=3.4 copies/ml(NGI Product License Application to FDA)Roche Amplicor Monitor v2.0 1 IU/mL=0.9 copies/ml(Roche Molecular Systems)Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0 1 IU/mL=2.7 copies/ml(Roche Molecular Systems)LCx HCV RNA Quantitative Assay 1 IU/mL=3.8 copies/ml(Abbott Diagnostics)Bayer bDNA 3.0:1 IU/mL=5.2 copies/ml(Bayer Development Group),未知HCV RNA 样本,甲实验室 5000拷贝/ml,乙实验室 10000拷贝/ml,丙实验室 50000拷贝/ml,丁实验室 20000拷贝/ml,实验室结果的互通性,20000IU/mlHCV RNA 样本,甲实验室 40000拷贝/ml1IU/ml2拷贝/ml,乙实验室 10000拷贝/ml 1IU/ml0.5拷贝/ml,丙实验室 50000拷贝/ml1IU/ml2.5拷贝/ml,丁实验室 20000拷贝/ml1IU/ml1拷贝/ml,实验室结果的互通性,谢 谢,
