荧光光谱分析法.ppt

,第五章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理第二节 荧光定量分析方法第三节 荧光分光光度计,某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光光致发光（二级光）。,光致发光,荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。,分子荧光分析的特点：,灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至10-12 g/ml。选择性好线性范围宽应用范围窄,第一节 荧光分析法的基本原理,1.分子荧光的产生,一、分子荧光 molecular fluorescence,分子能级比原子能级复杂在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能层室温下大多数分子处于基态的最低振动能层,在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态,用符号S0表示,分子吸收辐射后,电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为激发单重态,用符号S表示。（S1 S2 S3）,电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为+1/2和+1/2,s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3）,S0,小结：分子能级与跃迁 基态(S0)激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；第一、第二、电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、电子激发三重态 T1、T2；,电子能级的多重性 M=2S+1,平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；,S0S1、S2 允许跃迁；S0T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；,小结：激发单重态与激发三重态的不同 激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-810-6s），而激发三重态的长（10-410s）基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁,激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,荧光：10-710-9s，第一激发单重态的最低振动能级基态磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态,辐射和非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s,内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层基态(荧光多为 S1 S0跃迁)，发射波长为 3的荧光，10-710-9s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：3 2 1；,系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的非辐射跃迁。禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间跨越，通过自旋轨道耦合进行。10-6s,外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态(T1 S0跃迁)；发光速度很慢：10-4100s、磷光的能量比荧光小 电子由S0进入T1的过程：（S0 T1禁阻跃迁）S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 光照停止后，可持续一段时间,2.荧光的激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluorescence spectrum,（1）荧光的激发光谱,激发光谱：表示不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。,绘制激发光谱：固定发射波长(选最大发射波长),然后以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度F对激发波长作图，即为激发光谱。,荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。,激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长 ex,（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）,荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光波长固定在ex处，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F 对发射波长作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。,发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？,激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes位移 荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。激发光谱与发射光谱之间的波长差值：振动弛豫、内转换等物辐射跃迁损失了部分能量。,b.荧光光谱的形状与激发波长无关 电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2、1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如 3。为什么？,c.镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。,各小峰波长递减值与振动能级差有关，各小峰的高度与跃迁几率有关。,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能级的几率较大的话，相反跃迁也如此。,二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：,物质的荧光量子产率范围一般是多少?,如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。,2.有机化合物的分子结构与荧光的关系,（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移,（4）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强。,（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,三、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure,影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响 同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是因为在极性溶剂中，*跃迁所需的能量差E小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。,2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0以下，温度每降低10，f增加3，在80时，f为1。,当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和pH13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。,3.溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,4.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,5.荧光熄灭剂,荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。,6、散射光,小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。,瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。,拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。,散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长,选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰,a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。,硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱,四、荧光试剂,荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围,1.有机化合物的荧光分析,脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物(衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。,能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：,1荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物，典型反应如下：,荧光胺及其水解产物不显荧光。100mg荧光胺溶于100ml无水丙酮中，放置24小时后即可使用。取相当于10mg药物的甲醇或水溶液0.lml，加适宜pH值的磷酸缓冲溶液5ml，加荧光胺试剂0.lml，混合，放置15分钟后测定荧光强度。荧光条件为：ex=275、390nm，em=480nm。,2邻苯二甲醛(OPA)在2巯基乙醇存在下，pH910的缓冲溶液中OPA能与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的a氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA 500mg溶于10ml乙醇中，加200ml 2巯基乙醇，将此混合液加至1L 3的硼酸溶液中，再用KOH调节至pH10，即为常用试剂溶液。荧光条件为：ex=340nm，em=455nm。,31二甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯)能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。取50mg或100mg试剂，溶解于500ml无水丙酮中即可使用。与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰肼(DansylNHNH2)，它能与可的松的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为：ex=365nm，em=500nm左右。丹酰氯试剂不稳定，其水解产物DansylOH呈蓝色荧光，必须暗处保存，每周重新配制。,2.生物与有机化合物的分析,无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配合物后，可测量约60种元素及离子 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土采用荧光分析法 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定 铜、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,2.无机化合物的分析,第二节 荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,当一束强度为I0的紫外/可见光照射一浓度为c、液层厚度为d的液槽时，可在溶液的各个方向观察到荧光，其,由于能产生荧光的物质占被分析物的数量相当有限，且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光，所以荧光法很少用来定性分析,吸收光强度为Ia透过光强度为It荧光强度为F,垂直方向,（=I0-It）,荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度Ia,F=K(I0 It),K：取决于荧光效率f,根据Beer Law,F=K(I0-I0 10-c l)=KI0(1-10-c l)=KI0(1-e2.303 c l),由于 ex=1+x+x2/2!+x3/3!+xn/n!,所以 e-2.3 c l=1-2.3cl+(-2.3cl)2/2!+(-2.3cl)3/3!+,e-2.3 c l=1-2.3cl,e-2.3 cl=1-2.3cl 代入,F=KI0(1-e2.303 cl),F=KI0(1-1+2.3 c l)=2.3 K I0 l c,当荧光效率f、入射光强度I0、物质的摩尔吸收系数、液层厚度b 均固定不变时，荧光强度正比于该溶液的浓度,F=K c,荧光定量分析的依据,荧光强度可以在很弱的背景下被检测，这完全取决于检测器的灵敏度，也是荧光分析方法灵敏度高的原因,二、定量分析方法,1.标准曲线法 配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制F-c的标准校正曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出试样的浓度,2.比较法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之,空白调0，标品调100%或50%,第三节 荧光分光光度计,四个部分激发光源、样品池、双单色器系统、检测器特殊点有两个单色器，光源与检测器通常成直角,单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器光源：氙灯、高压汞灯、激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管,