茯苓多糖提取分离的方法.ppt
茯苓多糖的分离纯化,1 概述 2 茯苓多糖结构及理化性质 3 茯苓多糖的提取 4 茯苓多糖纯化方法,1 概述,多糖是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞中的天然大分子物质，一般常由100个以上甚至几千个单糖通过糖苷键连接而成，分子量在数万至数百万之间。多糖类包括植物多糖、动物多糖及微生物多糖，在某种程度上均具有免疫促进作用，而植物多糖尤为重要。多糖作为生物效应调节剂，主要影响网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞，以及RNA、DNA和蛋白质的合成，CAMP与cGMP的含量、抗体或补体的形成以及干扰素的诱生旧1。多糖具有多方面的生物活性，能够调节机体免疫机能，具有抗病毒、抗菌、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功能，因而越来越受重视，尤其是对其抗肿瘤作用的研究已达到分子受体水平。多糖的抗肿瘤途径主要为直接抑制肿瘤细胞的生长、抗氧化、清除自由基，改变肿瘤细胞膜的生长特性、诱导肿瘤细胞凋亡及影响癌基因的表达等一-,现代研究认为茯苓的主要成分为茯苓聚糖、茯苓酸、蛋白质、卵磷脂、脂肪、胆碱等。有效成分主要是茯苓多糖。它能增强小鼠的淋巴细胞功能；促进体液免疫；可使胸腺淋巴结增大；末梢血中的细胞数量增多。茯苓多糖还有很强的抗肿瘤作用，可延长患癌症动物生存期。,茯苓多糖 据国内的一些研究报道，对于茯苓多糖主要有两种定义。一种认为茯苓多糖是由茯苓菌核提取得到的，分子中主要是13葡萄糖结构，糖链上分布有少量的16结构的葡萄糖侧链。如潘琦、何兰茜等。另一种是认为茯苓菌核中含有的为茯苓聚糖(pachyman),茯苓聚糖经化学修饰切去分子主链上的16葡聚糖支链后,得到13葡聚糖称为茯苓多糖(pachymaran)，如蒋先明,石清东。,2 茯苓多糖结构及理化性质,茯苓多糖的结构是50个13结合的葡萄糖单位中有一个16结合的葡萄糖基支链和1到2个16结合的葡萄糖基间隔。茯苓多糖难溶于水，可溶于碱液，不溶于高浓度乙醇、正丁醇及丙酮等有机溶剂，没有抗肿瘤活性，但经化学修饰或结构改造后，如用Smith降解或氧化法去掉16支链后则可大大提高新茯苓多糖的水溶性并使之表现出多种生物活性。,硫酸酯化茯苓多糖结构,3 茯苓多糖的提取,茯苓多糖主要存在于茯苓细胞壁中，按照溶解度的不同又分为水溶性茯苓多糖和碱溶性茯苓多糖。通常采用水提醇沉法、碱提醇沉法提取。水溶性多糖的提取主要与提取次数、时间、固液比及温度等因素有关。随着提取次数增多，多糖的浸出率明显增高，但提取次数不易过多，一般为两次，否则，将造成后期工作量增大，提取成本过高。提取时间延长可提高多糖的浸出率，但浸提时间过长，将造成提取工艺延长。同时，还有可能增加杂质的溶出，通常选3h。固液比也影响多糖的浸出，在保证浸出率的前提下，尽可能减少液体体积，以减少浓缩工作量。多糖的浸出率还与浸提温度有关，随后者的升高而提高，但温度过高可能破坏多糖的结构，一般选择80提取。碱溶性多糖的提取一般在4下进行，其影响因素除以上几点外，还与碱浓度有关，常采用0.5mol/L。在乙醇沉淀步骤中，浸提液浓缩比及乙醇加量是影响茯苓多糖沉淀率的主要因素,3.1水提醇沉法,称取一定量茯苓粉末热水浸提抽滤滤液减压浓缩(浸提液浓缩液=101)95%乙醇沉淀（含醇量达80%）于冰箱中静置过夜离心沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤真空干燥得茯苓多糖粗品。该法采用水作为溶剂，具有价廉、无毒、操作安全等优点，其缺点是浸提时间长且提取率较低。,3.2 稀碱浸提法,稀碱法浸提碱溶性茯苓多糖应注意，在提取结束后应迅速用醋酸中和，以免多糖活性受影响。取一定量茯苓粉末溶于0.5 mol/L稀碱液中，4放置过夜，滤液以10%的醋酸中和至中性，再加入95%乙醇沉淀，以下步骤同水提醇沉法。该法提取率较水提醇沉法高，但浸提程序较繁琐，浸提条件较剧烈，极易破坏多糖的立体结构，使其生物活性受到限制。,3.3 酶+热水浸提法,该法通过外加酶降解茯苓的细胞壁，从而促进茯苓多糖的浸出。通常加入蛋白酶或植物复合酶，后者主要是由纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶等组成的混合酶系。采用植物精提复合酶+热水浸提法提取茯苓多糖，在普通热水浸提基础上加入酶解步骤，通过改变酶加入量、酶解温度、酶解时间等因素将茯苓多糖的浸出率提高到热水浸提法的2.32倍。采用有机溶剂预处理一木瓜蛋白酶水解加热水浸提法提取多糖，使得水溶性多糖的提取率明显提高，比常规浸泡水煮法的提取率约高85%。酶解法可以在较低的温度下提高多糖的提取率，与传统的热水浸提法相比，浸提时间缩短，得率提高，是水溶性茯苓多糖提取的好方法。,3.4 微波、超声波辅助提取法,微波提取法利用加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，从而使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进而出现裂纹，从而使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物。利用微波辅助法提取茯苓多糖，在微波占空比42%，固液比为150，提取时间18 min条件下，提取率达2.792%，为传统水回流提取法的两倍。该法具有受热均匀、快速、高效、安全、节能等优点，近年来，普遍应用于多糖的提取。超声波提取技术也是近年来发展起来的一种提取生物活性物质的方法，具有方便、快速、提取物活性高的特点。赵声兰等采用超声波法提取茯苓多糖，但提取率不高，最高达到1.6%。,3.5 发酵醇沉法,发酵醇沉法提取茯苓多糖包括胞外多糖的提取及胞内多糖的提取，前者将发酵液离心得上清液，浓缩至一定体积，乙醇沉淀，将沉淀物用丙酮、乙醚洗涤，得胞外多糖。后者包括胞内水溶性多糖及碱溶性多糖的提取。水溶性多糖的提取:取有机溶剂处理（脱脂）后的茯苓菌丝体粉末采用水提醇沉法进行提取；碱溶性多糖的提取:将上述提取水溶性多糖后的菌丝体滤渣用5 倍量0.5 mol/L 的NaOH浸提，步骤同稀碱浸提法。,液体发酵具有易于操作、节约资源、产率高、周期短、可大规模投入工业生产等优点，已逐渐成为获取茯苓多糖的主要方法。发酵茯苓菌丝体中总多糖的提取率较天然茯苓低，这可能因为发酵茯苓菌丝体多糖的提取工艺不完善，有待进一步优化，也可能由于发酵茯苓菌丝体中总多糖占总糖的比例低于天然茯苓。,4 茯苓多糖纯化方法,茯苓多糖提取之后，经常混有脂类、蛋白质、低聚糖等杂质，需对其进行除杂纯化，所得茯苓多糖为粗多糖，是多糖的混合物，化学组成不均一，可通过季胺盐沉淀法、分步沉淀法、凝胶层析法、超滤分级等方法分离纯化，成为单一组分多糖。,（1）脂类物质的去除,脂类不溶于水，易溶于有机溶剂。常用的溶剂有乙醚、石油醚、氯仿甲醇混合溶剂等。其中乙醚溶解脂肪的能力强，应用最多。但含约2%的水分，含水乙醚会同时抽出糖分等非脂成分，所以使用时，必须采用无水乙醚作提取剂，且要求样品无水分。,氯仿甲醇是另一种有效的溶剂，它对于脂蛋白，磷脂的提取效率较高，特别适用于水产品、家禽、蛋制品等食品脂肪的提取。,石油醚溶解脂肪的能力比乙醚弱些，但吸收水分比乙醚少，没有乙醚易燃，使用时允许样品含有微量水分，这两种溶液只能直接提取游离的脂肪，对于结合态脂类，必须预先用酸或碱破坏脂类和非脂成分的结合后才能提取。因二者各有特点，故常常混合使用。,索氏提取法,原理 用无水乙醚或石油醚等溶剂回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，回收溶剂后所得到的残留物，即为脂肪（或粗脂肪）。一般食品用有机溶剂浸提，挥干有机溶剂后得到的重量主要是游离脂肪，此外，还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂等物质，所以用索氏提取法测得的脂肪，也称粗脂肪。,适用范围与特点 此法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不易吸湿结块的样品的测定。索氏提取法测得的只是游离态脂肪，而结合态脂肪测不出来。,仪器,索氏提取器。电热恒温水浴（5080）。电热恒温烘箱（80120）。,滤纸筒的制备 样品制备 索氏提取器的准备 抽提 回收溶剂,试剂 无水乙醚或石油醚 本实验用乙酸乙酯,测定步骤,将滤纸裁成8cm15cm大小，以直径为2.0cm的大试管为模型，将滤纸紧靠试管壁卷成圆筒型，把底端封口，内放一小片脱脂棉，用白细线扎好定型，在1001050C烘箱中烘至恒量（准确至0.0002g）。,滤纸筒的制备,样品制备 样品于1001050C烘箱中烘干并磨碎，或用测定水分后的试样。准确称取25g试样于滤纸筒内，封好上口。,索氏抽提取器的准备 索氏抽提取器是由回流冷凝管、提脂管、提脂烧瓶三部分所组成，抽提脂肪之前应将各部分洗涤干净并干燥，提脂烧瓶需烘干并称至恒量,将装有试样的滤纸筒放入带有虹吸管的提脂管中，倒入乙醚，满至使虹吸管发生虹吸作用，乙醚全部流入提脂烧瓶，再倒入乙醚，同样再虹吸一次。此时，提脂烧瓶中乙醚量约为烧瓶体积2/3。接上回流冷凝器，在恒温水浴中抽提，控制每分钟滴下乙醚80滴左右（夏天约控制650C，冬天约控制800C），抽提34h至抽提完全（视含油量高低，或812h，甚至24h）。可用滤纸或毛玻璃检查，由提脂管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下痕迹。,抽提,回收溶剂,取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚，当乙醚在提脂管内将虹吸时立即取下提脂管，将其下口放到盛乙醚的试剂瓶口，使之倾斜，使液面超过虹吸管，乙醚即经虹吸管流入瓶内。按同法继续回收，将乙醚完全蒸出后，取下提脂烧瓶，于水浴上蒸去残留乙醚。用纱布擦净烧瓶外部，于1001050C烘箱中烘至恒量并准确称量。或将滤纸筒置于小烧杯内，挥干乙醚，在100 1050C烘箱中烘至恒量，滤纸筒及样品所减少的质量即为脂肪质量。所用滤纸应事先用乙醚浸泡挥干处理，滤纸筒应预先恒量。,结果计算,式中-脂类质量分数，%；m-试样质量，g;m1-提脂瓶质量，g;m2-提脂瓶与样品所含脂肪质量，g;或 脂类（质量分数）=（抽提前滤纸筒质量-抽提后滤纸筒质量/样品质量）100%,此法原则上应用于风干或经干燥处理的试样，但某些湿润、粘稠状态的食品，添加无水硫酸钠混合分散后也可设法使用索氏提取法。乙醚回收后，烧瓶中稍残留乙醚，放入烘箱中有发生爆炸的危险，故需在水浴上彻底挥净，另外，使用乙醚时应注意室内通风换气。仪器周围不要有明火，以防空气中有机溶剂蒸气着火或爆炸。提取过程中若有溶剂蒸发损耗太多，可适当从冷凝器上口小心加入（用漏斗）适量新溶剂补充。提取后烧瓶烘干称量过程中，反复加热会因脂类氧化而增量，故在恒量中若质量增加时，应以增量前的质量做为恒量。为避免脂肪氧化找成的误差，对富含脂肪的食品，应在真空干燥箱中干燥。,说明,（2）去蛋白,常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。Sevage 法：利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与 Sevage试剂氯仿：正丁醇=5：1（V/V）5：1 混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与 Sevage 试剂交界处。此法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。三氯醋酸法 于样品液中加入适量的三氯醋酸，混匀后静置过夜，离心过滤弃去滤渣，收集滤液，测定糖浓度和蛋白质浓度,茯苓多糖鉴定及含量测定,真菌多糖在199nm处有特征吸收峰苯酚硫酸法 多糖类成分在硫酸作用下先水解成单糖并迅速脱水生成糖醛衍生物然后和苯酚溶合成有色的化合物即为橙黄色溶液且颜色稳定此溶液在适当波长处(490nm)有特征吸收可测定多糖含量结果准确重现性好。,*茯苓多糖硫酸酯(PS)A值 分光光度计吸收值*加刺激原L PS后,B 淋巴细胞增殖显著增加*免疫抑制剂5-Fu 则显著抑制脾脏和胸腺的生长,5 茯苓多糖的抗肿瘤作用,本实验结果表明PS 显著促进荷瘤小鼠脾脏和胸腺淋巴器官的发育生长,体外对小鼠淋巴细胞尤其是B 淋巴细胞的增殖有显著促进作用,且可显著提高正常小鼠N K 细胞杀伤活性,可以通过促进淋巴细胞增殖,增强机体特异免疫功能而发挥抗肿瘤作用。而且PS 可以拮抗免疫抑制药52Fu 所致的免疫抑制。,
