种子的扩大培养及灭菌.ppt

种子扩大培养的目的与要求,种子制备实例,种子制备的技术概要,种子的扩大培养,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的概念:,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,一、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,1、斜面(谷氨酸棒杆菌AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,2.一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,3.二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束活力旺盛,种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,一、种子制备的过程,1-砂土孢子；2-冷冻干燥孢子；3-斜面孢子；4-摇瓶液体培养；5-茄子瓶斜面培养；6-固体培养基培养；7、8-种子罐培养；9-发酵罐,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,二、实验室阶段,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点，最终培养物可分为两类：,对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,获得一定数量和质量的孢子,孢子培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。,对于产孢子的微生物,获得一定数量和质量的菌丝体,便于操作，但需要更仔细的控制。,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,二、实验室阶段,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,二、实验室阶段,三、生产车间阶段,1、培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,2、培养基选择的原则,目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,三、生产车间阶段,例：柠檬酸发酵,以蔗糖为原料,成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5%20%NH4NO3 0.225%0.11%K2HPO4 0.03%MgSO4.H2O 0.025%0.025%KCl 0.015%琼脂 2%,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,3、发酵级数的确定,谷氨酸：三级发酵,一级种子（摇瓶）二级种子（小罐）发酵,青霉素：三级发酵,一级种子（小罐）二级种子（中罐）发酵,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,三、生产车间阶段,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,三、生产车间阶段,4、接种量的确定,移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积,过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,三、生产车间阶段,5、种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,三、生产车间阶段,舒琴，林产化学与工业，2004,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,6、种子的质量要求：,量：要求达到一定的浓度,质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH 酶活等,无污染,种子的扩大培养,种子制备的技术概要,三、生产车间阶段,灭 菌,污染杂菌的危害防止杂菌污染的措施灭菌的方法培养基的湿热灭菌空气的除菌,1、污染杂菌的危害,使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或产品质量下降；杂菌可能会分解产物；杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，使生化反应发生异常变化；发生噬菌体污染。,2、防止杂菌污染的措施,设备灭菌并确保无泄漏所用培养基必须灭菌通入的气体应经除菌处理种子无污染，确保纯种培养过程中加入的物料应经灭菌处理，并在加入过程中确保无污染,3、灭菌的方法,化学灭菌射线灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤除菌,灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。应用的范围有培养基灭菌；气体除菌；设备及管道灭菌等。,化学灭菌,一些化学试剂能使微生物中的蛋白质、酶及核酸发生反应而具有杀菌作用。常用的化学药剂有甲醛、氯、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐、臭氧等。化学药剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入后不易除去，一般不用于培养基的灭菌。,射线灭菌,即利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法。波长为（2.1-3.1）10-7m的紫外线具有灭菌作用，最常用的波长是2.53710-7m但紫外线穿透能力低，仅用于表面消毒和空气的消毒。,干热灭菌,常用的干热条件为在160下保温1h，灭菌效果不如湿热灭菌。一般要求保持干燥的实验器具和材料（培养皿、接种针、固定化细胞用的载体材料等）可用干热灭菌。,湿热灭菌,即利用饱和水蒸气进行灭菌。蒸气有很强的穿透力，在冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。同时，整齐价格低廉，来源方便，灭菌效果可靠。培养基灭菌、发酵设备及管道灭菌、实验用器材的灭菌，普遍采用湿热灭菌。通常的灭菌条件是在121维持30min。,过滤除菌,即利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。本法只适用于澄清流体的除菌。工业上利用此法大量制备无菌空气，供耗氧微生物的深层培养使用。热敏性培养基也采用过滤方法来除菌。产品提取过程中，也可用此法处理料液，获得无菌产品。,4、培养基的湿热灭菌,微生物的死亡速率,湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的数量成正比，即：,式中，N为培养基中活微生物的个数；,为微生物受热时间，s,K为比死亡速率，s-1,4、培养基的湿热灭菌,理论灭菌时间,Ns为灭菌结束时培养基中活微生物数，一般取0.001个，即灭菌失败的概率为千分之一。N0为灭菌开始时培养基中活微生物数，可以参考一般培养基中活微生物数为每毫升（12）x107个。,4、培养基的湿热灭菌,即将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸气将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。过程包括升温、保温（121，30 min)和降温三个阶段，灭菌主要在保温过程实现。显著缺点是对培养基成分破坏大、升降温时间长。,培养基的分批灭菌,4、培养基的湿热灭菌,将配制好的培养基在通入发酵罐前进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（130140），短时间保温后（58 min),被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。以高温、快速为特征，具有对培养基破坏小，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点。,培养基的连续灭菌,5、空气的除菌,流量：连续提供一定流量的压缩空气，单位时间（min)单位体积（m3)培养基中通入标准状况下空气的体积（m3)一般为0.10.2。压强：表压为0.20.4MPa.进入过滤器前，相对湿度70%，以防止过滤介质受潮。温度可比培养温度高1030。洁净指标：每立方米空气中，尘埃粒子数最大允许值0.5m的为3500，5m的为0，微生物最大允许数为5个浮游菌/m3,1个沉降菌/m3,发酵用无菌空气的质量标准,发酵厂所使用的空气除菌流程，随各地的气候条件及设备条件不同而有很大的差别。要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。气流速度可由操作来控制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在5060的条件下过滤。,5、空气的除菌,空气除菌流程,流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热。传热系数高，节约冷却用水，油水分离较完全。此流程适合潮湿地区。,1、两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程,第一级冷却到30-35，第二级冷却到20-25。,2、冷热空气直接混合式空气过滤除菌流程,特点：可省第二冷却分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量较少，利用压缩空气的热量来提高空气温度。此流程适合中等湿含量地区。,3、高效前置过滤除菌流程,特点：无菌程度高,5、空气的除菌,粗过滤器：拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时也有一定除菌作用。空气压缩机：提供动力，克服随后各设备的阻力。空气贮罐：消除压缩空气的脉动。冷却器：空压机出口气温一般在120左右，必须冷却，此外还可达到降湿的目的。旋风分离器：除去压缩空气中的较大的水滴和油滴，保护过滤介质。丝网分离器：除去旋风分离器无法除去的更小的雾滴。加热器：从丝网分离器中出来的空气，相对湿度仍为100%，必须在进入过滤器前加热将适度降低到70%以下。过滤：是除菌的主要手段。,空气除菌流程分析,