碱性磷酸酶的分离纯化鉴定.ppt

分离纯化的一般程序,选择材料,破碎细胞,提取,分离纯化,分析及鉴定,AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中），AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），,原理：,操 作,一、取材及匀浆 取兔肝2g，剪碎，加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分匀浆。记录体积（取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）二、提取 加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过滤，留上清。计体积。,三、分离纯化1、50丙酮沉淀AKP 加入等体积丙酮，3000rpm5min，留沉淀，加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。（取0.1ml留作B液，稀释10倍）2、30乙醇溶解AKP 每ml溶液中加入95乙醇0.46ml 2000rpm5min，留上清（记录体积）3、60乙醇沉淀AKP 每ml溶液中加入95乙醇0.86ml 3000rpm5min，留沉淀，加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。（取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍）,4、33丙酮溶解AKP 每ml溶液中加入0.33ml丙酮 2000rpm5min，留上清（记录体积）5、50丙酮沉淀AKP 每ml溶液中加入0.36ml丙酮 3000rpm15min，留沉淀，5ml Ph8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀（D液，不稀释）,四、分析及鉴定1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法）3、比活性及纯化倍数计算,分光光度法（Spectrophotometry）,根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收（即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（Absorption spectrometry）。不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来,（一）基本原理,光具有波粒二相性。波长和频率是光的波动性的特征。,1、光的基本知识,紫外分光光度计（200400nm）可见光分光光度计（400760nm）红外分光光度计（7601000nm）,2、定量分析的理论基础 LambertBeer定律,A KLC,吸光度(Aabsorbance,A)消光度(degree of extinction,E)光密度(optical density,D),K-吸光系数,是物质的特征性常数。,对比法进行定量分析,A样=K L C样,A标=K L C标,A样,A标,K L C样,K L C标,C样,C标,C样=A样 C标/A标,单色光、平行光（max）溶液均匀、清澈、无散射溶液性质稳定，比色皿中无化学反应适用于稀溶液（）,LambertBeer定律的适用范围：,溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。试剂空白：当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。,参比溶液的选择,基本组件及常见分光光度计,分光光度计的使用,1.打开电源预热15分钟2.选择波长（max）3.光标指向Trans4.打开光门，调节0；关上光门调节1005.重复4一次6.将光标指向ABS7.读数,磷酸苯二钠,碱性磷酸酶,苯酚+磷酸盐,碱性,苯酚+4-氨基安替吡啉+铁氰化钾,红色醌式化合物,AKP活性测定基本原理磷酸苯二钠法,37保温 15分钟各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min,510nm 比色,酚标准液浓度,稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液）/25 10 5 1,蛋白含量测定基本原理BCA法,二喹啉甲酸，BCA,37保温 30分钟,562nm 比色,蛋白标准液浓度,稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液）/50 20 5 1,计 算,每一步总活性=酶活性 每一部记录的体积数,