研究生基因表达调控熊.ppt

基因表达与基因表达调控,南昌大学医学院生化与分子生物学教研室,第一节 基因表达调控基本概念第二节 基因表达调控的基本原理 第三节 基因表达的过程和特点第四节 原核生物基因表达的调控 第五节 真核生物基因表达的调控,第一节 基因表达调控基本概念,一、基因表达的概念 基因（gene）：是为生物活性产物（RNA或蛋白质）编码的DNA功能片段，是遗传的基本单位。基因组(genome)：指一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。基因表达(gene expression)：指基因转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。,基因表达是受调控的,二、基因表达的特异性 基因表达表现为严格的规律性：即时间、空间特异性。时间、空间特异性由特异基因的启动子（序列）和(或)增强子与调节蛋白相互作用决定。,（一）时间特异性 按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性（temporal specificity）。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性（stage specificity）。,（二）空间特异性 在个体发育、生长的全过程，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，称之为基因表达的空间特异性（spatial specificity）。基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种空间分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，因此基因表达的空间特异性又称细胞特异性（cell specificity）或组织特异性(tissue specificity)。,三、基因表达的方式 按对内、外环境信号刺激的反应性，基因表达的方式分为：（一）基本表达 管家基因:某些基因在一个生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因称管家基因（housekeeping gene）。管家基因的表达方式称基本（或组成性）基因表达，这类基因表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，不受其它机制调节。,（二）诱导和阻遏 在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在一定的环境中表达增强的过程为诱导（induction）。如果基因对环境信号应答时被抑制，这种基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。诱导和阻遏在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。,环境信号,表达增强,表达减弱,诱导,阻遏,协调表达,在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达（coodinate expression）。,四、基因表达调控的生物学意义（一）适应环境、维持生长和增殖；外环境不断变化 机体相应的适应性应答生物体适应变化着的环境、维持正常生长（二）维持个体发育与分化。高等动物各种组织、器官的发育与分 化都是由一些特定基因控制的,第二节基因表达调控的基本原理,一、基因表达调控的多层次和复杂性基因激活 转录起始基本控制点 转录后加工 mRNA降解 蛋白质翻译 翻译后加工修饰 蛋白质降解等,复制水平转录水平转录后的加工修饰翻译水平翻译后的加工修饰蛋白质的转运和细胞定位,基因表达的潜在环节,基因表达的调节与基因的结构、性质，生物个体或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关。,1.特异DNA序列和调节蛋白质,二、基因转录激活调节的基本要素,原核生物,操纵子(operon)机制,共有序列(consensus sequence)决定启动序列的转录活性大小。,某些特异因子（蛋白质）决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。,2 操纵序列 阻遏蛋白(repressor)的结合位点,当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻碍转录。,3)调节蛋白 原核生物基因调节蛋白分为三类：特异因子、阻遏蛋白和激活蛋白，都是DNA结合蛋白。特异因子决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。阻遏蛋白可识别、结合操纵序列，抑制基因转录，介导负性调节。激活蛋白可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。,真核生物,不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列，如TATA盒、CAAT盒等，这些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。,特异DNA序列,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,真核生物特异DNA序列 顺式作用元件分为启动子、增强子和沉默子等。,2)真核基因的调节蛋白,还有蛋白质因子可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的表达，称顺式作用。,由某一基因表达产生的蛋白质因子，通过与另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，调节其表达。,反式作用因子(trans-acting factor),这种调节作用称为反式作用。,指的是反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合。通常是非共价结合，被识别的DNA结合位点通常呈对称、或不完全对称结构。,绝大多数调节蛋白质结合DNA前，需通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体(dimer)或多聚体(polymer)。,DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节最终是由RNA聚合酶活性体现的。1、启动序列/启动子与RNA聚合酶活性 启动序列或启动子核苷酸序列会影响其与RNA聚合酶的亲和力，从而直接影响转录起动和频率。2、调节蛋白与RNA聚合酶活性 特异调节蛋白在适当环境信号刺激下在细胞内表达，通过DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性，从而使基础转录频率发生改变，出现表达水平变化。,3.RNA聚合酶,第三节 基因表达的过程和特点,一、基因的转录,（一）、基因转录的基本方式原核生物与真核生物1、RNA合成的前体分子是四种 NTP；2、参与转录的酶:RNA 聚合酶；3、在RNA聚合反应中，形成3，5磷酸二酯键；,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,4、双链DNA中只有一条链作为RNA合成的模板：不对称转录,5、基因转录的基本过程一致。1）RNA 聚合酶与DNA模板特殊区域结 合，转录起始；2）RNA链延伸；3）RNA合成终止，新链释放。,（二）、mRNA转录后的加工、修饰与运输,1、5端帽结构的形成2、3端的剪接和多聚腺苷酸的加入3、mRNA前体的剪接4、选择性剪接5、RNA编辑（RNA editing）,原核生物真核生物,1、帽子结构,1、5端帽结构的形成,5 pppGp,帽子结构的生成,CPSF:Cleavage-and-polyadenylation specificity factor;CStF:cleavage stimulatory factor CF:cleavage factor;PAP:poly(A)polymerase;PABII:poly(A)-binding protein II,2、3端的剪切和多聚腺苷酸的加入,snRNP与hnRNA结合成为并接体,3、mRNA前体的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,A,donor site,acceptor site,It takes places in a two-step reaction，snRNPs are involved.,4、选择性剪接（alternative splicing）,指基因的初级转录产物通过不同的剪接方式而实现的外显子的选择性使用。,剪接方式：1）使用不同的剪接位点；2）交替使用外显子；3）反式剪接:在两个或更多不同的基因初级转录物中的外显子，剪接成为一条成熟的mRNA。,RNA 剪接,J.Clin.Invest.2003,可变剪接,J.Clin.Invest.2003,选择性剪接的实际例子：-原肌球蛋白 mRNA(-tropomyosin),意义之一,可变剪接使得单个基因能编码多种蛋白，在产生蛋白组的复杂性起着主要作用。人类编码蛋白的基因3 4万个，蛋白种类约10万。EST和cDNA数据库分析，人类编码蛋白的基因发生可变剪接；可变剪接微阵列分析，发生可变剪接。,意义之二,可变剪接可产生带有提前的终止密码子(premature termination codon,PTC)的mRNA,使之通过无意密码子介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)途径降解,从而控制基因表达量。NMD是一种监管系统,其基本功能是除去不正常的转录产物。通过对EST和cDNA数据库分析,约35%可变剪接产物被NMD降解。,现在可以肯定在真核细胞中至少存在着三种mRNA的降解方式：1、依赖于脱腺苷酸的降解，2、无义密码介导的mRNA的降解 3、核酸内切酶的水解。其中依赖于脱腺苷酸的降解方式是细胞内大多数mRNA降解的主要途径。,5.RNA的编辑(mRNA editing),RNA的编辑是对mRNA前体的序列进行的改编。在mRNA 前体分子的碱基序列中：删去C、插入U：C被U取代；删去G、插入A：G被A取代。,apo B100,apo B48,RNA编辑的加工方式，大大增加了mRNA的遗传信息流量。,6666：C U,（三）、mRNA的运输,在真核生物细胞核内，mRNA的前体与核蛋白结合形成不均一核糖核蛋白颗粒（heterogeneous ribonucleo-protein particle，hnRNPs）而运输。,The physical form of hnRNA is a ribonucleoprotein particle(hnRNP),in which the hnRNA is bound by proteins(20 types).,hnRNP的功能：1、hnRNP蛋白有一个或几个可以结合 RNA 的结构域；2、至少有一个与其它蛋白相互作用的结构域；3、防止 mRNA 前体内部形成二级结构,有利于mRNA 前体与其它大分子接近并发生相互作用；4、与 RNA 中特异的剪接序列、剪切和多聚A 作用的序列以及与 RNA 加工因子相识别，并参 与 mRNA 前体加工；5、参与 mRNA 的运输。,Diagram of the RNP motif domain,防止 mRNA 前体内部形成二级结构,有利于mRNA 前体与其它大分子接近并发生相互作用,二、蛋白质的生物合成-翻译,（一）、肽链翻译的基本方式 蛋白质合成的过程1、氨基酸的活化及与特异tRNA连接；2、肽链合成的起始；3、肽链合成的延长；4、肽链合成的终止。,真核生物蛋白质合成的特点：1、翻译与转录不偶联2、起始因子种类多3、核蛋白体较大，成分复杂4、起始甲硫氨酰-tRNA 是非甲酰化的,（二）、肽链翻译后的加工修饰1、翻译起始点的调控2、蛋白质翻译后的折叠3、某些肽段或氨基酸的切除 1）信号肽的切除 2）多蛋白的加工 3）氨基酸残基的共价化学修饰,1、翻译起始点的调控 翻译通常从第一个AUG起始，但有时会因第一个AUG周围的、能被核糖体亚基识别的信号序列太弱而被错过，从而由以下的AUG开始翻译（“leaky scanning”）,遗漏扫描（leaky scanning）,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠,1.热休克蛋白(heat shock protein,HSP)：HSP70、HSP402.伴侣素(chaperonins)：GroEL和GroES家族3.蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI),2、蛋白质翻译后的折叠,（1）信号肽的切除,信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有一含 13 16个氨基酸残基（以疏水氨基酸残基为主）的保守肽段称信号肽。,3、某些肽段或氨基酸的切除,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,（2）多蛋白的加工,3）氨基酸残基的共价化学修饰,对新生肽链中某些氨基酸残基进行共价修饰，是翻译后处理的重要内容。反应的主要类型有以下几种：,(1)乙酰化 主要发生在N末端氨基和赖氨酸的氨基上；(2)甲基化 发生在氨基、氨基、精氨酸的胍基和C末端的羧基和侧链的羧基上；(3)磷酸化 主要发生在丝氨酸的羟基和苏氨酸及酪氨酸的羟基上；（4）泛酸化 发生在氨基和氨基上；（5）转氨基酸作用 主要发生在N末端的氨基上；（6）多聚ADP核糖基化 主要发生在精氨酸的胍基上；（7）糖基化 可能通过N糖苷键连接于天冬氨酰的酰胺基上，也可以通过O糖苷键连接于丝氨酸和苏氨酸的羟基上以及羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基上，也可以通过S糖苷键连接于半胱氨酸的巯基上。,（三）、蛋白质的分拣与转运,1、蛋白质的分拣（protein sorting）,一种是细胞内蛋白质合成和转运同时发生的，即翻译转运同步机制（cotranslational transfer）另一种是蛋白质从核糖体上释放后才发生转运，属于翻译后转运机制（posttranslational translocation）,2、蛋白质的转运,（1）翻译转运同步机制 分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质网和高尔基体滞留蛋白等。首先在游离核糖体上合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后，部分多肽以芽泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。（2）翻译后转运机制 叶绿体蛋白和线粒体蛋白。在细胞质游离核糖体上被完全合成后通过新生肽的信号序列直接运往目的地并被加工。,第四节 原核生物基因表达的调控,原核基因转录调节-主要调节环节在转录起始 一、基因转录调节特点 1、因子决定RNA聚合酶识别特异性 2、操纵子模型的普遍性 3、阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性 原核基因转录调节以负性调节为主。,（一）因子与启动子的作用模式,RNA聚合酶全酶2,在原核生物的发育分化过程中，不同基因的有序表达是由于不同因子在不同时间产生并发挥作用而引起的。,二、转录起始的调控,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),目前发现多种因子常规基因表达采用的是70（分子量70kD）热休克反应：细菌中:当细菌受到热应激，则由32启动另一套转录，所生成的产物称为热休克蛋白（Hsp），Hsp编码的基因称为热休克基因（hsp）真核生物中也存在热休克基因只是功能各异。,（二）乳糖操纵子调节机制,1、乳糖操纵子(lac operon)的结构,没有乳糖存在时,2、阻遏蛋白的负性调节,有乳糖存在时,无葡萄糖，cAMP浓度高时,有葡萄糖，cAMP浓度低时,3、CAP的正性调节,4、协调调节,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,低半乳糖时,高半乳糖时,葡萄糖低 cAMP浓度高,葡萄糖高cAMP浓度低,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,三、转录终止的调控,A T P,1.依赖 Rho因子的转录终止,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,2.非依赖 Rho因子的转录终止,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,E,D,C,B,A,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,3、转录衰减,色氨酸操纵子,分枝酸,色氨酸,162bp,139bp,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱：序列1/2序列2/3序列3/4,UUUU 3,前导肽,前导mRNA,1.当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,衰减子结构就是终止子可使转录,RNA聚合酶,终止,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,2.当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,1、基因重组,沙门菌鞭毛素基因的调节,四、其他转录调节机制,P1,P2,P2,P1,2、SOS反应,紫外线,与DNA 损伤修复有关的酶和蛋白质,DNA,五、原核生物翻译水平调节（一）蛋白质分子的自我调节（二）反义RNA对翻译的调节（三）稀有密码子对翻译影响（四）mRNA的稳定性对翻译影响,调节蛋白结合 mRNA 靶位点，阻止核蛋白体识别翻译起始区，从而阻断翻译。调节蛋白一般作用于自身mRNA，抑制自身的合成，因而这种调节方式称自我控制。,（一）蛋白质分子的自我调节,翻译的负调控机制 e.g.,ferritin,（二）反义RNA对翻译的调节 反义RNA指具有与特异mRNA序列互补配对的RNA。亦称为干扰mRNA的互补RNA。功能：调节基因表达；抑制有害基因的表达。,根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 降解；类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。,三、翻译调控,（三）稀有密码子对翻译影响,稀有密码子是指在基因中使用频率很低的密码子。已知dnaG和rpoD（编码RNA聚合酶亚基）及rpsU（30S核糖体上的S21蛋白）属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同。dnaG产物50拷贝 rpoD为2800拷贝 rpsU则高达40 000拷贝细胞通过翻译调控，解决了这个问题。,研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子，也就是说这些密码子在其他基因中利用频率很低，而在dnaG中却很高。,许多调控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在细胞内含量也很低，编码这些蛋白的基因中密码子的使用频率和dnaG相似，而明显不同于非调节蛋白。高频率使用这些密码子的基因翻译过程极容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。,（四）mRNA的稳定性对翻译影响,真核生物基因的翻译调控的一个重要作用是控制 mRNA 的稳定性。在某些真核细胞中的 mRNA 进入细胞质以后，并不立即作为模板进行蛋白质合成，而是与一些蛋白质结合形成 RNA 蛋白质（RNP）颗粒。这种状态的 mRNA 的半衰期可以延长。mRNA 的寿命越长，以它为模板进行翻译的次数越多。,第五节 真核生物基因表达的调控,与原核生物不同点1、真核细胞染色体中包装的DNA处于转录抑制状态2、真核基因调控以正性调控为主3、转录起始涉及一套转录因子的参与4、转录和翻译在时空上是分开的,（一）RNA聚合酶,一、真核基因表达调控特点,RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA聚合酶,RNA聚合酶：45S-rRNARNA聚合酶：hnRNARNA聚合酶：5S-rRNA、tRNA,（二）活性染色体结构变化,对核酸酶敏感2.DNA拓扑结构变化3.DNA碱基修饰变化4.组蛋白变化,活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。,2.DNA拓扑结构变化,天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在；,基因活化后,3.DNA碱基修饰变化,CpG岛甲基化常发生在某些基因的5侧翼区的CpG序列,实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA 特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的 DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，可见DNA的甲基化对基因表达调控是重要的。,组蛋白的作用 组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。,4.组蛋白变化,转录活跃的染色质缺乏 H1组蛋白，其它核心组蛋白可被乙酰化（acetylation）修饰。,核心组蛋白有两个结构域,中心结构域:组蛋白与组蛋白结合,富含Lys的氨基端结构域：Lys 被转乙酰基酶乙酰化,乙酰化的作用：1、使核小体对DNA的亲和力降低2、使 DNA 对 Dnase 敏感性增高，有利于转录调控因子结合,乙酰化，转录乙酰化，转录,（三）正性调节占主导 真核基因基因组大，通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。原因有二：（1）采用正性调节机制更有效；（2）采用负性调节不经济。（四）转录与翻译分隔进行 转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位，可分别进行调控。（五）转录后修饰、加工,三、真核基因转录激活调节,（一）顺式作用元件,1.启动子,真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,TATA盒 转录因子TF-D结合位点,典型的启动子：CAAT盒和（或）GC盒 TATA盒 转录起始点,最简单的启动子：TATA盒 转录起始点,但是，不是所有的启动子都有TATA盒,2.增强子(enhancer),1）概念：指真核细胞中能增强启动子转录作用的 远方顺式作用元件。,2）作用特点：,a.远距离作用；,b.无基因特异性；,c.没有方向性。,从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。,基因远端的增强子促进转录复合体的装配,增强子,（二）反式作用因子,1.转录调节因子分类（按功能特性）,*基本转录因子(general transcription factors),是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。,*特异转录因子(special transcription factors),为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,转录抑制因子,2、反式作用因子与DNA结合的模体,螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix）,螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix）,亮氨酸拉链（leucine zipper）,锌指（zinc finger）结构,最常见的DNA结合域,最常见的一种模体，螺旋被一个转角分隔，羧基一端为识别螺旋，结合到大沟中，之外的部分可能与DNA的接触中起“微调”的作用。,（1）螺旋转角螺旋模体（HTH）,（2）锌指模体(zinc finger),C CysH His,常结合GC盒,如:TFA有九个锌指模体,（3）亮氨酸拉链模体（leucine zipper）,两个蛋白质分子近C端肽段各自形成两性-螺旋，-螺旋的肽段每隔7个氨基酸残基出现一个亮氨酸残基，两个-螺旋的疏水面互相靠拢，两排亮氨酸残基疏水侧链排列成拉链状形成疏水键使蛋白质结合成二聚体，-螺旋的上游富含碱性氨基酸（Arg,Lys），肽段借Arg,Lys侧链基团与DNA的碱基互相结合而而实现蛋白质与DNA的特异结合。,（4）螺旋-环-螺旋模体（HLH）,常结合CAAT盒,这种蛋白质模体由两个两性-螺旋通过一个肽段连接形成螺旋-环-螺旋结构。,二聚体,N端,富含碱性氨基酸,两个蛋白质通过两性螺旋的疏水面互相结合，与DNA结合则依靠此模体附近的碱性氨基酸侧链与DNA的结合而实现。,参与RNA-pol转录的TF,（三）mRNA 转录激活及其调节,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,四、翻译水平的调控（一）mRNA的稳定性对翻译的影响真核生物基因的翻译调控的一个重要作用是控制mRNA的稳定性。1、5帽子结构的调控作用2、3 PolyA尾的调控作用3、mRNA的去稳定元件4、RNA干涉（RNA interference,RNAi）,RNAi 是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象。RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。,RNA干涉（RNA interference,RNAi）,第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。,siRNA的两条单链末端为5磷酸和3羟基，且3端均有3个突出的核苷酸。果蝇中的RNase样核酸酶称为Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。,第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指 导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。,RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,紫色为正义 RNA段，蓝色为反义 RNA段，绿色为目标信使RNA，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平，达到干扰目的,Dicer:RNase样核酸酶,RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC),除上述RNAi机制外，转基因真核生物中的dsRNA尚可引起相应基因的甲基化和染色质重构、凝集、异染色质化，基因甲基化和异染色质化还可能促使异常RNA（aberrant RNA）产生，最终导致基因沉默。,RNAi的放大效应机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。,作为一门生物技术 RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post trans-criptional gene silence,PTGS)。,RNAi 的特点,转录后水平的基因沉默较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。,在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。,2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z.Fire和45岁的Craig C.Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而成为诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。,（二）mRNA非翻译区的二级结构对翻译的影响,1、mRNA 5非翻译区形成茎环二级结构,2、蛋白因子结合mRNA结构元件 运铁蛋白的mRNA 5非翻译区有铁反应元件（iron response element，IRE）。当细胞没有铁时，阻遏蛋白与铁蛋白mRNA启动子区域铁反应元结合，阻止翻译进行；当有铁存在时，阻遏物不再与IRE结合，翻译顺利进行。,（三）翻译起始因子的可逆磷酸化对翻译的影响,eIF-4F磷酸化，蛋白质合成增加 eIF-4F去磷酸化，蛋白质合成减少,eIF-2去磷酸化，蛋白质合成减少,三、RNA pol和pol 的转录调节（一）RNA pol转录体系的控制人rRNA前体基因的启动子的两个元件：核心元件与上游控制元件RNA pol的两种转录因子：上游结合因子与选择性因子,（二）RNA pol 转录体系的控制 tRNA和5SrRNA基因启动子位于转录起始点下游即转录区内，称为内部控制区（internal control regions,ICR）tRNA基因的ICR主要由盒和盒两个元件组成，RNA pol 转录起始需要转录因子TF C和TFB。5SrRNA基因的转录需要三种转录因子：TF C、TFB和TF。,真核生物与原核生物的调控差异,Thank You!,