真菌多糖的生理活性、研究技术.ppt

桑黄子实体多糖的分离纯化工艺及生物活性研究,报告人：程伟,主要内容,真菌多糖概述桑黄多糖概述桑黄子实体多糖的提取桑黄子实体多糖的纯化桑黄多糖的结构分析与活性研究应用前景,继基因组学、蛋白质组学之后，糖类研究成为21世纪巨大的科学前沿。药物糖与功能糖、用糖进行能源/资源开发等正成为我国经济的增长点。糖工程共性关键技术主要围绕糖制备技术，以及糖分离、分析和功能评价技术展开。包含各种各样天然多糖制备、多糖降解与分离、寡糖化学-酶合成、糖化学-酶法转化等技术。,真菌多糖概述,2001年Science（Vol.291）43篇论文涉及糖的研究。2007年Nature（Vol.26）7篇论文综述糖化学糖生物学研究进展。发达国家在糖研究上不惜斥巨资建立各种平台，展开糖生物学、化学糖生物学、糖组学、糖芯片、糖工程、糖药物等领域的研发。,真菌多糖：1、一类天然高分子化合物，它广泛存在于真菌的细胞壁中，是由醛基和酮基通过糖苷键连接起来的高分子聚合物。2、有螺旋状的三维立体结构，其构型近似于DNA，是一种型的多糖。3、是控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。4、其进入体内后不会被消化、分解、吸收，能够和细胞膜上的受体结合，从而能发生药理活性。因此，是一类具有广泛药理活性的功效十分显著的活性物质。,真菌多糖分类：一般分为胞外多糖和胞内多糖；高等真菌多糖主要是胞内多糖，它主要存在于菌丝体的细胞壁或细胞间质中，通过普通粉碎不能提高其含量的是胞外多糖，反之则是胞内多糖。,真菌多糖主要分布于真菌的菌丝、子实体及其发酵液中。在不同的部位含量有所不同，在真菌的菌丝体的细胞壁和细胞质中存在较多，其他地方较少。故真菌多糖主要是在菌丝体细胞壁和细胞质中提取。,真菌多糖具有降血压、血脂、健胃保肝、抗氧化、延缓衰老、抗感染、抗辐射、促进核酸和蛋白质的生物合成，修复损伤的组织细胞等多种功效。真菌多糖的抗肿瘤作用是目前所知其最为重要的生物活性，也是研究最为活跃的部分。,桑黄多糖的概述,近年来，真菌多糖及其复合物的研究引起越来越多的关注。桑黄，是目前发现的生物抗癌领域公认的抗癌效率较高的一种大型药用真菌。桑黄多糖是从桑黄子实体、菌丝体、发酵液中分离出的，具有多种生物活性，是一类真菌多糖，现已被开发成多种药物和功能性食品添加剂。,桑黄多糖的提取,桑黄多糖存在于桑黄的菌丝体和子实体中，桑黄菌丝在液体发酵时，有的将多糖分泌到胞外，形成胞外多糖；有的只留在胞内，形成胞内多糖。若直接食用桑黄不易达到保健治疗作用，只有将其有效成分提取和纯化，才能提高功效。桑黄多糖多以氢键、盐键等与其它物质聚合在一起，因而须以各种有效方法破坏多糖链与其它物质的共价结合，方能达到提取多糖的目的。,目前，提取多糖常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法和冷热稀碱提法。其中水提法被采用得较多，适合于提取水溶性多糖；稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖，提取时间宜短、温度不超过50，以防止糖苷键断裂；稀碱法适合于提取碱溶性糖。,大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4-5倍的低级醇和丙酮，一般在pH 值为7.0左右沉淀，制得粗多糖。由于水提时间长且效率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性，而采用酶法提取真菌多糖（用复合酶与热水浸提相结合的方法），具有条件温和、杂质易除及提取率高等优点。,超声技术提取超声波作为一种提取技术已有报道，它具有时间短、效率高、提取量高等特点，同时可防止提取物在长时间、高温条件下发生降解、褪色等变化。,超声波协同纤维素酶提取多糖的方法，通过空化、振荡等作用，使酶分子构象及催化部位微环境发生变化，从而影响纤维素酶的催化活力。此外，低强度超声不仅可使细胞周围形成微流，还可使动植物细胞产生胞内环流，从而提高了细胞膜和细胞壁的通透性，利用这一特点可达到加快细胞壁释放多糖的速度、缩短提取时间、提高多糖提取率的目的。,微波法提取微波技术是近几年来用于天然植物有效成分提取的一项新技术，它具有快速、高效、安全、有效成分得率高、节能等特点。据报道有人采用微波技术应用于板蓝根多糖的提取，结果表明，粗多糖得率和多糖质量分数均明显高于单独使用水煎煮法。,多糖的纯化是将粗多糖混合物分离为单一的纯多糖的过程。在多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色素及小分子物质等杂质，必须分别除去一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。,桑黄多糖的纯化,纯化方法（1）按溶解性不同分离：分步沉淀法、盐析法（2）按电离性质不同分离：季胺盐沉淀法（3）柱层析法：凝胶柱层析法、纤维素阴离子交换剂柱层析法、活性炭柱层析法、离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法、三种层析柱联用。,蛋白质一般常用醇析法和Sevag法、三氟二氯乙烷法等除去；色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用DEAE-纤维素或DuoliteA-T来吸附色素；低聚糖等小分子杂质可通过逆向流水透析法除去，然后可通过分部沉淀法、柱层析法、超过滤法等方法进行纯化。,多糖制备过程中蛋白质的脱除是目前分离纯化多糖的难点。Sevag法需要消耗大量的有机溶剂，且操作烦琐；三氟三氯乙烷的沸点较低(bp56)易挥发，不宜大量应用；三氯乙酸可引起多糖的降解，从而影响其生理活性；酶价格昂贵，不适合工业化生产。可以借鉴其它蛋白质脱除的方法，例如用天然澄清剂能简化提取工艺，提高多糖纯度。,脱色也是多糖提取纯化过程中面临的一个难题。活性炭会吸附多糖而造成多糖的损失；H2O2氧化脱色容易引起有些多糖的降解。可探索将粗多糖反复溶解与醇析，这可能是多糖脱色的可行方法。从总多糖中分离单一多糖组分时，各种色谱介质价格昂贵，样品制备量极小，仅限于实验室研究，尚不能规模化生产；而且单一多糖组分生理活性的研究鲜见报道。,桑黄多糖的纯度检测 经过分级纯化的多糖在测定结构前须进行纯度鉴定而且多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也并不均一，仅代表相似链长的多糖分子的平均分布，通常所谓的多糖纯品也只是一定相对分子质量范围的多糖的均一组分目前常用于多糖纯度的鉴定方法有：高效液相、凝胶层析法、电泳法、色谱法、旋光度法等。值得指出的是，纯度检查一般要求有上述两种方法以上，其结果才能肯定。,桑黄多糖分子量的测定 一般测定的多糖分子量是总分子量。测定方法有葡聚糖凝胶柱层析、凝胶电泳、高压液相色谱法、超离心法、改良型膜渗透法和高效凝胶渗透色谱法。,成分分析 真菌多糖分结构多糖和活性多糖。真菌细胞壁中往往含有几丁质，为一类聚氨基葡萄糖，属于结构多糖；另一类活性多糖是由真菌菌丝体产生的一类次生代谢产物，研究这类多糖对真菌本身作用较少，一般认为是真菌储存能量的载体之一，而对它们的药理活性研究得较多，因此把这一类多糖称为活性多糖。真菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。,一级结构 一级结构是指其单糖残基的组成、排列序列、连接方式等。真菌多糖的一级结构主链主要有2 种：（1）葡聚糖（2）甘露聚糖真菌多糖的二级结构 二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合形成的各种聚合体，这只是关系到其分子主链的构象，而不涉及侧链的空间排布。,三级结构 三级结构是指由多糖中糖残基中的羟基、羧基、氨基及其他功能团，通过非共价作用而形成的有序、规则而粗大的空间构象。四级结构 四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体。,结构的分析方法 对于多糖一级结构，传统的分析方法是用化学分析法。多糖样品用酸全部水解后，经纸色谱或薄层色谱与标准样品对照，并用气相色谱法测出多糖的相对含量。通过甲基化、Smith 降解和高碘酸氧化等确定多糖中单糖的连接点，然后用酶降解，逐步测出糖链顺序，用凝胶渗透色谱法测出多糖的平均分子量。这种方法所需要的样品量大，操作繁杂、费时，且分析精度不高。,现代仪器分析法是在化学分析法的基础上更进一步地了解和研究多糖结构特性的方法。与化学分析法相比，现代仪器分析法具有快速、准确、灵敏和操作方便等优点。,目前，在此方面应用较多的有紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）及电泳等。其中IR法和MS法是多糖结构分析的有效手段，而NMR法在解决糖的立体化学方面起着重要的作用。,多糖的高级结构分析 多糖的二级结构分析常用的手段是NMR技术。另外在多糖的三维结构测定中，X-射线衍射分析是较好的方法。,构效关系 活性多糖的化学结构是其生物活性的基础。多糖的构效关系就是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系，是当前糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题。可能是因为多糖的结构过于复杂，从总体上看，对多糖构效关系的研究很不完善。就多糖一级结构与其生物活性的关系而言，一方面多糖的糖组成和糖苷键类型对其生物活性有一定的影响，如从菌体中获得的活性多糖一般是由葡萄糖构成的，而且葡萄糖主链上的-1,6 糖苷键是抗肿瘤所必需的。,对具有抗病毒活性的硫酸酯化多糖而言，硫酸酯化均多糖的活性大于硫酸酯化杂多糖，且-1,3-D-葡聚糖和以-1,3-D-葡聚糖为主的多糖活性明显高于-1,6-D-葡聚糖。多糖一级结构对其生物活性影响的第2个方面是多糖中的一些官能团。多糖中的官能团种类或有无官能团对其生物活性有极大的影响，而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以多糖中官能团的改造已成为研究多糖构效关系的有力手段。常用于多糖官能团改造的方法有降解、羧甲基化、硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化、二乙基氨基乙基化、碘化和氨化等。,对不同的多糖来说，不同官能团改选方法对其生物活性的影响各不相同，除了大多数硫酸酯化多糖具有明显的抗病毒作用外，其他官能团对多糖生物活性的影响尚无规律可循，这无形之中增加了多糖构效关系研究的难度。多糖的高级结构与其生物活性的关系至今尚不十分清楚，但高级结构比一级结构在活性方面起更大的决定作用，学者对于这一观点是达成共识的。有些多糖具有相同的一级结构，但活性大不相同，这主要是由其高级结构的差别引起的。,应用前景,应用真菌多糖以其多方面的生物活性和安全无毒副作用而备受青睐，人们近年来开始重视真菌多糖的开发，国内外对真菌多糖的开发利用发展很快。由于其显著的生物活性，且几乎没有任何毒副作用，所以许多真菌多糖被用作保健食品的功能添加剂。,研制出一系列药品和保健品，在传统的丸、汤剂基础上又开发了针剂、冲剂、片剂、胶囊、糖浆乃至保健口服液、饮品、速溶茶、酒饮料等各种产品。目前市场上投放的真菌多糖类保健品有上百种之多。,桑黄保健品,桑黄药品,桑黄护肤品,国际上食、药用真菌的医疗保健品走俏，正朝抗癌、增寿、强身、益智、美容以及提高免疫力和防止衰老等为特点的系列制品开发。茯苓多糖已制成片、针剂用于临床，为癌症化疗的辅助治疗剂，并已成为治疗慢性乙型肝炎的良药之一。,前景目前对各种多糖的作用机理的还不完全确定，尚有许多种类不能人工栽培，加之生长环境不同、培养条件不同、提取分离技术不同都会造成多糖结构上的差异，因而影响其活性。准确地分析多糖的结构是认识、改造多糖的前提，而且是多糖研究的难点之一。,展望未来,在桑黄多糖研究与开发上，应做好以下几个方面的工作：（1）进一步加强食药用真菌多糖构效关系和与靶细胞的作用机制及一系列后续生物学效应的研究，为产品的研发奠定坚实的理论基础。（2）实施技术创新，革新现有的分离、提纯及鉴定技术，为获得组分均一、效果稳定的产品提供技术支撑。,（3）建立相关的行业标准和国家标准，整体上提升产业水平，促进产业化进程步伐。（4）运用先进的生物信息学和生物系统学的理论和方法，强化食药用真菌种质资源的鉴定和保护，为建立现代化的原料生产基地创造条件。,谢 谢 大 家,