真核生物基因表达与调控.ppt

第五章 真核生物基因表达与调控,第一节 染色质结构与基因转录,核小体影响转录因子及RNA聚合酶对DNA的识别和结合，所以借助一系列变化以暴露顺式作用元件及邻近区域，是真核基因组DNA结合转录调节因子并起始转录的首要条件。,按照染色质功能状态的不同分为：活性染色质：是具有转录活性的染色质。非活性染色质：是缺乏转录活性的染色质。染色质是否处于活化状态是决定转录功能的关键。,一、染色质结构的控制与重塑,1.活性染色质的特征：具有DNase I超敏感位点；多在调控蛋白结合位点（5启动子区）的附近，可能有利于调控蛋白结合而促进转录。很少有组蛋白H1与其结合；组蛋白乙酰化程度高；核小体组蛋白H2B很少被磷酸化；一些特殊的高速泳动组蛋白(如:HMG14和HMG17)只与活性染色质相结合。高速泳动组蛋白:是一种非组蛋白，在凝胶电泳中泳动速度快。组蛋白H3第110位Cys巯基的暴露。,组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录。被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因才能与转录复合物相互作用。因此，组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负控制因子。,2.染色质结构的控制与活性染色质的形成,3.染色质结构的重塑(chromatin remodeling),染色质重塑:是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。DNA 复制、转录、修复、重组在染色质水平发生,这些过程中,染色质重塑可导致核小体位置和结构的变化,引起染色质变化。ATP 依赖的染色质重塑因子可重新定位核小体,改变核小体结构,共价修饰组蛋白。重塑包括多种变化,一般指染色质特定区域对核酸酶稳定性的变化。,关于重塑因子调节基因表达机制的假设有两种:机制1:1 个转录因子独立地与核小体DNA 结合(DNA 可以是核小体或核小体之间的),然后,这个转录因子再结合1 个重塑因子,导致附近核小体结构发生稳定性的变化,又导致其他转录因子的结合,这是一个串联反应的过程。（重建）机制2:由重塑因子首先独立地与核小体结合,不改变其结构,但使其松动并发生滑动,这将导致转录因子的结合,从而使新形成的无核小体的区域稳定。（滑动）,ATP依赖的染色质重塑机制,二、组蛋白修饰与染色质结构,组蛋白的 N端是不稳定的、无一定组织的亚单位，其延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）可以改变染色质结构，从而影响邻近基因的活性。,1.核心组蛋白的乙酰化 基因活性受组蛋白转乙酰酶/脱乙酰酶(HAT/HDAC)的调节。酰基供体是乙酰辅酶A，受体是组蛋白的赖氨酸（或丝氨酸）残基。HAT活性增高,组蛋白分子过乙酰化,DNA表现为解链效应,促进基因转录;而HDAC活性增高则出现相反的效应,基因转录变沉默。HAT和HDAC的动态平衡对基因的转录活性的调节起关键作用。,2.组蛋白的甲基化,是非活性染色质的特征。发生在H3尾部 的赖氨酸残基和H4尾部的精氨酸残基上，由甲基转移酶催化。组蛋白的甲基化与染色质结构改变有关，进而会影响特异基因座内基因的表达。同时，组蛋白的甲基化也会影响到DNA的甲基状态改变。哺乳动物中组蛋白的去甲基化酶现在已经被发现。,3.组蛋白H1的磷酸化 至少有两种组蛋白可被磷酸化：H1和H3。磷酸化发生在组蛋白的丝氨酸 残基上，一般与基因活化相关。磷酸化可改变H1组蛋白与DNA的亲和力，直接影响染色质的活性。,真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5侧区的CpG序列中，实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录。甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。,三、DNA甲基化与转录阻抑,胞嘧啶甲基化反应,CpG岛:位于多种脊椎动物已知基因转录起始位点周围,由胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)组成的串联重复序列。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基化可导致基因转录被抑制。,与DNA甲基化作用相关的三种酶,构建性甲基化酶:在新位点通过识别特异序列识别DNA，它只作用于非甲基化位点；维持性甲基化酶:作用于半甲基化位点，把它们转变成完全甲基化位点。去甲基化酶：负责去除甲基。,构建性甲基化酶,维持性甲基化酶,去甲基化酶,DNA甲基化抑制基因转录的机理,作用机理：DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。,修饰作用与染色质状态的关系：,组蛋白的乙酰化（与基因活化有关）组蛋白的甲基化（与基因失活有关）DNA的甲基化（与基因失活有关）,失活状态,活化状态,组蛋白乙酰化,组蛋白脱乙酰化,组蛋白脱甲基化,组蛋白甲基化,DNA脱甲基化,DNA甲基化,第二节 真核生物基因的转录调节,在基因调控的众多环节中，转录起始的调节居于首要地位。与原核基因相似，真核基因的开关同样由特殊的DNA序列与DNA结合蛋白所控制。参与转录调节的蛋白因子从功能上可分为3类：基础转录因子（或称通用因子）：广泛分布于各种细胞类型，与核心启动子相结合，在转录起点附近和RNA聚合酶共同组成基础转录反应器。如TBP因子,真核生物的RNA聚合酶细胞核内，有三种：区别在于对-鹅膏蕈碱的敏感性不同。,此外，线粒体、叶绿体中也含有RNA聚合酶，其特性类似原核细胞中的RNA聚合酶，它们都是经过核基因编码、在细胞质中合成后再输送过去的。,以前认为与TATA盒结合的蛋白因子是TF-D，后来发现TF-D实际包括两类成分：TBP（TATAbox binding protein）：是唯一能识别TATA盒并与其结合的转录因子，是三种RNA聚合酶转录时都需要的；TAF（TBP相关因子，TBP-associated factors）：至少包括8种能与TBP紧密结合的因子。,上游因子：遍布各种细胞并呈组成型表达，通过特异结合上游启动子序列提高基础转录的水平。组成型表达：基因在所有情况下都以相同速度进行的表达，即无需诱导即可实现的基因表达。构成细胞基本组分的基因和细胞基本代谢相关基因通常以这种方式表达，以使细胞的基本功能得以维持。,可诱导因子:也属序列特异性结合蛋白，但它们的合成或激活过程受到细胞类型或发育时期的严格控制，并能对来自细胞或外界的信号作出迅速而准确的反应，进而从时间和空间上调节基因的转录，可诱导因子的识别序列又被称为应答元件。,真核启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用。真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长730bp。,一、基础转录及其调节1.启动子、RNA聚合酶和基础转录因子,RNA聚合酶的启动子（promoter）,-25bp含TATA序列(TATA 框,Hogness 框)作用：选择转录起点、控制转录精确性。-75bp含GGCCAATCT序列(CAAT 框)作用：控制转录起始频率。在-80-110bp区含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC 框）作用：调控起始和转录效率。,原核生物 TTGACA-TATAAT-起始位点-35-10真核生物增强子-GC-CAAT-TATAA5mGpp起始位点-110-70-25,真核与原核生物启动子的比较：,哺乳类RNA聚合酶启动子中常见的元件,核心启动子(core promoter)：指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游-25-30bp处的TATA盒。TATA盒位置极为保守，是许多通用转录因子的装配位点。核心启动子单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。,启动子中的元件可以分为两种：,转录起始点没有广泛的序列同源性，但多数转录本的第一个碱基为腺嘌呤，其两侧是嘧啶碱基，序列可表示为Py2CAPy5，这个区域被称为起始子（initiator，Inr）元件。Inr元件位于-3+5。,仅由Inr元件组成的启动子是具有可被RNA聚合酶II识别的最简单启动子形式。,The minimal pol II promoter can consist either of a TATA box plus InR or of an InR plus DPE(downstream promoter element).,-25,Py2CAPy5(-3+5),+28+32,上游启动子(upstream promoter)：包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能调节转录起始的频率，提高转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的调控。,2.基础转录的调节基础转录：指由核心启动子与通用因子结合后起始的转录过程。基因组中表达的基因分为两类：持家基因（house-keeping gene）：只含有通用因子及上游因子识别序列的启动子可以在各种细胞类型中发挥作用，用以合成细胞所必需的各种成分。由它所控制的基因呈组成性表达，如各种组蛋白基因。,奢侈基因（luxury gene）：是指导合成组织特异性蛋白的基因，对分化有重要影响，即组织特异性表达的基因。由它所控制的基因呈诱导性表达，如表皮的角蛋白基因、肌肉细胞的肌动蛋白基因和肌球蛋白基因、红细胞的血红蛋白基因等。这类基因与各类细胞的特殊性有直接的关系,是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因。,基础转录的过程,依赖于各通用因子间的相互作用,按照特定的时空顺序组建转录起始复合物,其中TBP与TATA框的结合则成为这一切的开端。影响起始转录所必需的各种活性（如解旋酶、ATPase、蛋白激酶活性等）的因素都将改变转录的效率。此外，核心启动子的完整性也将影响转录效率。,参与RNA-pol转录的TF,二、调节真核基因转录的顺式作用元件(cis-acting elements)真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)；近年又发现起负性调控作用的元件沉默子(silencer)及绝缘子（insulator）。,是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物。增强子通常占100200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。,(1)增 强 子:,增强子提高DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离14kb、甚至30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。,增强子的作用有以下特点：,增强子要有启动子才能发挥作用，否则增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子决定了它具有组织或细胞特异性。,An enhancer can activate a promoter from upstream or downstream locations,and its sequence can be inverted relative to the promoter,可降低基因启动子转录活性的一段DNA顺式元件。与增强子作用相反。沉默子的DNA序列被调控蛋白结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化，使基因表达活性关闭。,（2）沉默子,沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。,一种负调控元件，参与基因表达的负调控。作用：可控制顺式作用元件的行为，隔绝了激活或抑制效果沿染色质的过度传播。其作用可不受序列方向影响，能远距离发挥作用。,（3）绝缘子,An enhancer activates a promoter in its vicinity,but may be blocked from doing so by an insulator located between them.,作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：DNA结合域（DNA binding domain），多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；转录激活域（activating domain），常由30-100氨基酸残基组成，这结构域分富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类；连接区，即连接上两个结构域的部分。,三、转录因子的DNA结合域,与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以下几种：,1.锌指（zinc finger）2.螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)3.螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)4.碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）,1.锌指（zinc finger）,概念:与DNA结合的蛋白质中一小段保守AA与一个Zn2+结合起来形成蛋白质中一个相对独立的结构域。典型的“锌指”：锌以4个配价键与2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合，称为C2H2型锌指。其中靠近N端一侧的肽链形成反平行的折叠，对侧为螺旋，通过C端螺旋中带正电荷的残基识别DNA序列。,经典锌指的三维结构：一个折叠和一个螺旋,锌指可以串联重复排列，两指间7-8个氨基酸残基。3段螺旋（即3个锌指基序）恰好能填满1个螺距之间的DNA大沟，其中每段螺旋可在2个位点与DNA发生序列特异性结合。例：与GC盒结合的转录因子Sp1中就有连续的3个锌指重复结构。基序(motif):指DNA或蛋白质等生物大分子中的保守序列。在反式作用因子的结构中，基序一般指构成任何一种特征序列的基本结构。,转录因子Sp1的锌指基序,锌指上的螺旋负责与DNA作用,其它类型的锌指：C2C2型：一些甾类激素受体蛋白和酵母调节蛋白所具有，即Zn分别与4个Cys配位；C3H型：反转录病毒核衣壳蛋白所具有，即Zn分别与1个His和3个Cys配位；注意：一些RNA结合蛋白同样具有锌指基序。如TFA和翻译起始因子eIF2。,糖皮质激素受体,有两个螺旋，其间由短肽段形成的转角连接；长约20个氨基酸残基,其中羧基端的螺旋为识别螺旋(由79个氨基酸组成),负责识别DNA大沟的特异碱基序列；另一个螺旋(由79个氨基酸组成),没有碱基特异性,与DNA磷酸戊糖链骨架接触。在与DNA特异结合时,靠蛋白质的氨基酸侧链与特异碱基对之间形成氢键、疏水键和发生静电相互作用。,2.螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH),*两个螺旋被一个转角隔开*一个螺旋起识别结合DNA的作用,3.螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH),结构特点：含有两个螺旋,被不同长度的连接区隔开(环)，借助两个螺旋对应面上疏水基团的相互作用形成二聚体。在免疫球蛋白轻链基因的增强子结合蛋白E12与E17中，螺旋的N端一侧有碱性区。其DNA结合性质与亮氨酸拉链有相似之处，都包含与DNA结合的碱性区和形成二聚体的两性螺旋，因而也常被称为碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）,HLH基元附近有个高度碱性的区段为结合DAN所必须bHLH,结构特点：蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基。Leu出现在-螺旋疏水的一侧，并直线排列。两个蛋白分子的-螺旋之间依赖Leu残基之间的疏水作用形成一条拉链。二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。两个蛋白分子靠疏水力结合成二聚体。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。,4.碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）,The basic regions of the bZIP motif are held together by the dimerization at the adjacent zipper region when the hydrophobic faces of two leucine zippers interact in parallel orientation.,N-end,转录因子中除了含有DNA结合结构域外，还含有转录激活结构域。其结构特点因转录因子而异，根据氨基酸组成的特点，主要包括3种类型：（1）酸性激活域（2）富含谷氨酰胺的激活域（3）富含脯氨酸的激活域,5.转录因子的激活结构域(Transcriptional activation domain),共同点：它们之间并不存在较为明显的氨基酸序列的同源性，却都含有高比例的酸性氨基酸，产生出很强的净负电荷。例如：糖皮质激素受体蛋白质17/82.,（1）酸性激活域（acidic activation domain）,例：在组成型表达的转录因子Sp1的两个最强的激活域中，谷氨酰胺几乎占了25%，而带负电菏的氨基酸比例则非常低。,（2）富含谷氨酰胺的激活域（glutamine-rich activation domain）,与CAAT元件结合的组成型转录因子CTF/NF1，转录激活域位于转录因子的C-末端，其中酸性氨基酸及谷氨酰胺所占比例都很低，但含大量的脯氨酸，约占该区域的1/4。,（3）富含脯氨酸的激活域(proline-rich activation domain),转录产物的加工转运调控,1 RNA的不同剪接和编辑使同一基因转录产生出不同的蛋白质;2 RNA的切割和加polyA改变基因编码的蛋白质;3 RNA从核中转运到细胞质的过程受控制.,1.mRNA的稳定性与基因表达调控;2.mRNA 5前导序列对翻译水平的影响;3.翻译起始因子的磷酸化可抑制或选择性地加强蛋白质的合成;4.mRNA 3端的结构对翻译速率和mRNA寿命的影响;5.真核生物mRNA翻译起始的控制;6.翻译延伸过程对蛋白质合成的影响;7.微小的干扰RNA对mRNA翻译的负控制;8.蛋白质的加工折叠转运的调控;,翻译水平的基因表达调控,