真核基因表达调控模式.ppt

第七章 真核生物基因表达的调控,真核生物基因表达的特点,基因组结构庞大单顺反子重复序列断裂基因染色体转录调节区大转录和翻译分别在不同的亚细胞区域翻译后需要加工,多级调控,DNA水平,基因丢失基因扩增基因重排甲基化修饰染色质的结构状态,RNA水平,转录水平调控RNA的转录后加工mRNA向胞浆转运mRNA稳定性,蛋白质水 平,翻译过程翻译后加工蛋白质的稳定性,真核生物调控的特征,基因表达以正调控为主转录与翻译在不同的区域进行,无操纵子和衰减子个体发育复杂受环境影响较小,基因家族（gene family）,定义：真核基因组中来源相同,结构相似,功能相关的一组基因.可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重 复(duplication)和突变产生。特点：家族成员可以分布于不同染色体上 可集中于一条染色体上,串联排列在一起,形成基 因簇(gene cluster)有些成员不产生有功能的基因产物,这种基因称为 假基因(Pseudogene)a1：与a1相似的假基因,简单基因家族,特点：家族成员串联排列在一起 组成一个转录单位代表:rRNA基因家族(重复单元28S、18S、5.8s-rRNA),复杂基因家族,特点：家族成员串联排列在一起 独立的转录单位代表:组蛋白基因家族,发育相关复杂基因家族,特点：分布在不同的染色体上 独立的转录单位 基因顺序与表达顺序相关代表:珠蛋白基因家族,假基因(Pseudogene),核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不 能合成出功能蛋白质的失活基因。一般都不被转录,且 没有明确生理意义,可能是产生一种功能性非编码RNA,调节来自其等位编码基因的mRNA的稳定性 根据其来源可分为 复制假基因 已加工假基因 完全缺失存在于功能基因中的间隔序列 无5端调控序列 3末端紧接着有多聚腺嘌呤尾 两端常被721bp的正向重复序列包围,果蝇的sexlethal基因转移到小鼠体内，大多数小鼠表现正常，但有一个品系的小鼠在幼年期全部死亡。研究发现，sexlethal基因插入到makorin1p1假基因中部，破坏了该假基因的转录。如果将假基因makorin1p1敲除，makorin1基因将被关闭。,一、DNA水平调控,（一）染色质结构对基因表达的影响 染色体(chromosome):细胞在有丝分裂或减数分裂过程中,由 染色质聚缩而成的棒状结构。染色质（chromatin）:间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组 蛋白及少量RNA组成的线性复合结构,是间期细胞遗传 物质存在的形式。常染色质(euchromatin):压缩程度低,伸展状态,着色浅 异染色质(heterochromatin)：压缩程度高,聚缩状态,着色深 结构异染色质(constitutive heterochromatin)兼性异染色质(facultative heterochromatin),异染色质化 水蜡虫（Pseudococcus nipae）（2n=10）雌性:10条都是常染色质 雄性:来自父本的5条染色体依次被异染色质化 哺乳动物的剂量补偿（dosage conpensation）雌性哺乳动物X染色体的失活,巴尔小体（Barr body）L.Barr(1949年),1961,Mary Lyon提出了莱昂假说(Lyon hypothesiis)巴尔小体是一个失活的X染色体；在哺乳动物中，雌性个体细胞中的两个X染色体中有一个X染 色体在受精后的第16天（受精卵增殖到5000-6000，植入子 宫壁时）失活；两条X染色体中哪一条失活是随机的；X染色体失活后,细胞继续分裂形成的克隆中,此条染色体都 是失活的；生殖细胞形成时失活的X染色体可得到恢复。1974年Lyon又提出了新莱昂假说 认为X染色体的失活是部分片段的失活实验证据:无汗性外胚层发育不良(anhidrotic ectodermal dysplasia)三色猫 G-6-PDH,anhidrotic ectodermal dysplasia无汗性外胚层发育不良,毛发稀少牙齿异常无汗/少汗表皮和附件异常,X b X Bb 橙色B 黑色,三色猫,三色猫,6-磷酸葡糖脱氧酶(G-6-PD)的测定,(二)DNase的敏感性和基因表达 含有转录活性基因的染色质区域对DNase降解的敏感性要比 无转录活性区域高得多。这是由于此区域染色质的DNA蛋白质 结构变得松散，DNase易于接触到DNA之故 鸡的珠蛋白和卵清蛋白系统:,鸡胚红细胞,珠 蛋 白 基因+-,卵清蛋白基 因-+,鸡输卵管细胞,超敏感区域（hypersensitive region）或超敏感位点（hypersensitive site)一般在转录起始点附近，即5端启动子区域，少部分位于其它部位如转录单元的下游。,（三）端粒位置效应（telomere position effect，TPE）端粒处核小体的堆积紧密，导致该处附近的基因不表达 基因在染色体的位置不同，表达的效果也不同,(四)DNA的甲基化与去甲基化DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,可能存在于所有高等生物 中,DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化诱导了基因的重 新活化和表达 DNA甲基化的主要形式：CpG,用同裂酶（(isoschizomers)）可检测CCGG上C的甲基化状态 MspI 可切割CmCGG或CCGG，HapII可切割未甲基化CCGG,HapII,CG islands 高等真核生物中包含未甲基化CpG双核甘酸序列远低于其理论值.通常成串出现在随时准备好转录或转译的脱氧核糖核酸中甲基化酶 日常型（mainteance）：从头合成型（de novo synthesis）,在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较低。,去甲基化又可使基因恢复活性。5-氮胞苷没有游离的5-H，因而不能接受甲基，若将它掺入DNA取代胞苷是可以改变基因的甲基化状态，而达到去甲基化。,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）,次黄嘌呤核苷（HR）,GMP,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途径,嘧啶核苷酸生物合成途径,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶核苷激酶,氨基喋呤（AP）,氨基喋呤（AP）,从头合成途径,补救合成途径,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）,不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补,含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）,不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补,DNA甲基化抑制基因转录的机制 甲基化抑制基因转录的直接机制 甲基化抑制转录的间接机制 MeCP1（methylCpG-binding protein1）MeCP2（methylCpG-binding protein1）,DNA甲基化的生物学效应,X染色体失活亲本印迹肿瘤发生个体发育,CpG甲基化,DNA甲基化与X染色体失活 X染色体失活中心(X-chromosome inactivation center,Xic)X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位,定位在Xq13区（正好是Barr氏小体浓缩部位）。Xi-specific transcript(Xist)基因 只在失活的X染色体上表达 产物是一功能性RNA 没有ORF却含有大量的终止密码子 Xist RNA分子能可能与Xic位点相互作用,引起后者构象变化,易于结合各种蛋白因子,最终导致X染色体失活,亲本印记(imprinting)来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF-(胰岛素样生长因子)基 因可表达，而源于母本的则不能表达。选择性甲基化,目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。,印记基因与疾病 印记丢失（loss of imprinting）非印记基因失活,肿瘤发生 抑癌基因甲基化 不表达,(二)染色体(质)丢失(chromosome diminution)有的生物个体发育早期在体细胞中要丢失部分染色体，而在生殖细胞中保持全部的基因组马蛔虫（Parascaris equoorum）,第一次卵裂是横裂，产生上下两个子细胞第二次卵裂时下面的子细胞仍进行横裂，保持着原有的基因组，而上面的子细胞却进行纵裂，丢失了部分染色体长此下去最下面的子细胞总是保持了全套的基因组，将发育成生殖细胞，其余丢失了部分染色体片段的细胞分化为体细胞。此可能是由于在植物极中有特殊的物质的存在，这种物质具有保护染色体不受削减的功能。,小表瘿蚊（Mayetiole destructor）受精卵的细胞核分裂，而受精卵不分裂，形成合胞体（syncytium）。当核第3次分裂后，有两核移向卵后端的一个特殊区域，叫做极细胞质，在极细胞质中的核保持了全套的染色体（2n=40），将来分化为生殖细胞。而在一般的细胞质中，染色丢失了32条，只保留8条，将来分化为体细胞,(三)基因扩增,定义 细胞内某些特定基因的拷贝数专一性的大量增加作用 满足特定阶段生命活动的需要例子:组织中整个染色体组都进行扩增：在双翅目昆虫如果蝇（D.melanogaster）的唾腺 中，细胞不分裂但染色体却多轮复制，产生巨大的多 线染色体（polytenne chromosomes）（含多于1000条 染色单体）发育中的编程扩增 特定的基因簇的染色体外扩增 特定的基因簇原位扩增 哺乳动物培养细胞中定向基因的应激性扩增,polytenne chromosomes,特定的基因簇的染色体外扩增,两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增,非洲爪蟾的18S、5.8S 和28SrDNA的串联重复单位，它们成簇存在，形成核仁形成区。可是在卵母细胞中rDNA串联重复单位被剪切下来后环化，以滚环复制的形式进行扩增，使拷贝数扩大了1000倍以上。,特定的基因簇原位扩增,在黑腹果蝇的发育中，卵壳蛋白基因不被剪切，在表达之前，通过复制的重叠环而被扩增。,卵泡细胞中选择性扩增来满足在短期中对卵壳蛋白的大量需要,哺乳动物培养细胞中定向基因的应激性扩增,某些试剂可使那些对其产生抗性的基因大量扩增 dhfr 基因 二氢叶酸还原酶(DHFR)氨甲喋呤（methotrexate）均染色区（homogeneously staining region,HSR）双微体(double-minute chromosomes),均染色区（homogeneously staining region,HSR）,在高抗性细胞的染色体中，可以观察到扩增区域形成一延伸的染色体带称均匀染色区（homogeneously staining region,HSR）,双微体(double-minute chromosomes),染色体外的拷贝是怎样产生？两种可能：复制的附加环可能在dhfr基因附近起始，然后通过dhfr拷贝之间的非同源重组而产生 或是等位基因之间的非同源重组来起始这个过程。额外的拷贝可能是通过类似于重组的事件将其从染色体释放出来,产生抗体 B细胞 体液免疫 经法氏囊(Barsa of Fabricius)细胞分裂骨髓 经胸腺 调节免疫应答 T细胞 细胞免疫 杀伤抗元,（Thymus）,(四)基因重排,定义 改变基因组中有关基因序列结构(片断水平的拼接)，使相距很远的片断靠近作用 调控基因差别表达例子:B淋巴细胞基因重排,抗体有100万种以上，但一种淋巴细胞只产生一种抗体 指令学说：上世纪40年代由Pauling提出 克隆选择学说：1957年 Burnet提出 一种浆细胞只能产生一种抗体 抗原可选择某一淋巴细胞克隆 体细胞重组学说：上世纪60年代提出 认为在浆细胞成熟的过程中，染色体发生 了重排，多个区基因中的一个和基因 组合，产生一条DNA。1976年由利根川进证实,它们用分子杂交的方法发现在胎鼠细胞中编码区和区的DNA顺序相隔较远。但在成熟的抗体细胞中（淋巴瘤细胞）这两个区域却紧密相连；表明在淋巴细胞分化过程中，免疫球蛋白基因曾发生过体细胞重组。,在任何动物中每家族的V基因和C基因都隔开一段距离，这种排列的方式称为胚系（germ line）模式，在生殖细胞中和除了免疫系统外的所有体细胞中都是按此排列。,当B细胞发育时，一个特殊的L-VK片段和其中一个JK连接，再和CK连接，然后转录，切除内含子，成为成熟的mRNA,在所有的胚系片段的分界线处都有相同的保守序列，这些序列参与连接反应。每一个一致序列都含有七聚体（heptamer）和九聚体（nonamer），中间被12bp或23bp的间隔序列所分开；,在七聚体靠近编码单位的一端双链断裂，将V基因和J-C基因之间的完整片段释放出来，这个片段被剪切的末端被称为信号端（signal ends）V和J-C座位的剪切末端称为编码端（codig ends）。两个编码端共价连接形成编码连接（codig joint），将V和J片段连接起来，如果两个信号端也相连接，那和以这个被切下来的片段也会形成环状分子,连接反应导致序列的改变，影响到L链上V-J连接处或H链上的V-D及D-J连接处的氨基酸编码。这种改变是酶在起作用，使DNA断裂和重接。在以上的重组过程中会产生碱基的丢失或插入，,酵母的变配型的转变酵母的交配型（mating-type）不同交配型（mating-type）的菌株相互接合才能产生二倍体的合子。相同的交配型之间是不能接合的 细胞的交配型是由MAT（mating）座的遗传信息决定的。在此座位上带有MATa等位基因的细胞就叫做a型细胞；同样带有MAT等位基因的细胞就称为型细胞交配型的转换 某些品系的酵母具有转换（switch）交配型的能力，即从a型变成为型，或从型转变为a型。这些品系带有显性等位基因HO，并频繁地改变它们的交配型（常常每代改变一次），带有隐性等位基因ho的品系有一个稳定的交配型，其交配型改变的频率仅约10-6。转换的存在表明所有的细胞都含有MATa和 MAT型的潜在信息，MAT和MATa同在一条染色体上，HML位于MAT的左边，MHR位于MAT的右边。,暗箱模型（cassette model）MAT是活性暗盒（active cassette）,可以是型，也 可以是a型.HML和HMR是沉默暗盒（silent cassettes）,都不能表达,通常HML带有暗盒,而HMR带有a暗盒，所 有的暗盒都带有编码交配型的信息，但只有MAT可以表 达。当活性暗盒信息被沉默暗盒信息所取代时就发生了 交配型转换。新“装进”活性暗盒的信息就可以表达。,MAT,MAT a,每种暗盒都有共同的序列，侧翼序列W，X和Z夹着一个中心区Y。在a和型暗盒中仅Y区域是不同的，分别称之为Ya和Y。中心区的两侧区域本质上都是相同的，仅HMRa缺少了W区。,原推测HML和MHRa之所以“沉默”是由于它们缺乏启动子，但发现MAT和MATa特异性mRNA的转录是在Y片段的内部起始的，而沉默暗盒和MAT暗盒中的Y序列是相同的，必定具有相同的启动子。遗传学家们发现了4个不连锁的沉默信息调节基因SIR（silent information regulator）1、2、3和4，这些基因产物共同起反式作用（它们并不在同一条的染色体上）来阻止沉默暗盒中的基因表达。若这4个SIR基因中任何一个基因失去作用的话，那么HML和HMRa基因同样可转录。,E沉默子和I沉默子，或EL（near HML）和ER（near HMR）具有负的增强子的作用，它们能对远隔25Kb的启动子发挥作 用，而且没有方向性，所以它们被称为沉默子（silencers）可能具有复制起点作用的ASR序列相联温度敏感sir突变体的表达被用于研究HML和HMR的阻遏与DNA复制之间的关系。带有sirts突变的细胞在高温下培养，HML和HMR得到表达，然后降低温度使SIR活性的恢复，当细胞被阻断G1期时，HML和HMR仍持续表达。但当DNA复制时，HML和HMR就被抑制了，这表明与E元件相连的ASR序列对于建立HML和HMR的阻遏是必须的。这是一种阻遏的新形式，现在我们还不知其分子机制是怎样的。,转换按DNA链断裂重组的模式进行重组的起始需要HO酶的切割。MAT的Y区被降解直到Y区左侧的同源区。MAT的左、右两侧是可以和HML或HMR 配对的。以HML或HMR的Y区为摸板拷贝出新的序列取代了MAT被降解的区域，配对座位再彼此分离,二、参与基因调控的顺式作用元件和反式作用因子,（一）顺式作用元件 真核生物DNA序列（非编码序列）和被转录的结构基因距离较近 和转录调控有关 启动子（启动子上游近侧序列）增强子 沉默子,增强子(enhancer)能增强真核生物启动子功能 顺式作用元件（DNA序列）增强子、启动子交错覆盖/连续 没有增强子 启动子不表现活性 没有启动子 增强子无法发挥作用 不受序列方向和距离的制约 有细胞和组织特异性 无基因特异性沉默子(silencer)负性调节元件 阻遏基因转录,反应元件 真核细胞处于某一特定环境时，有反应的基因具有相同的顺式作用元件，这一类顺式作用元件-反应元件（DNA序列）特点：（）具较短的保守序列（）与转录起始点的距离不固定（）可位于启动子或增强子内 举例：激素反应元件（HRE）,（二）反式作用因子（转录因子,transcriptionf actor）,真核细胞核中发挥作用的蛋白质因子 DNA结合蛋白 核内蛋白 反式因子有两个必需的结构域 DNA 结合结构域：与顺式元件识别、结合 转录激活结构域：与RNA聚合酶结合 可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）反式作用因子结合 识别顺式作用元件中的靶序列 启动转录,转录调节因子分类（按功能特性）基本转录因子(general transcription factors)是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定 三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别 特异转录因子(special transcription factors)个别基因转录所必需,决定该基因的时间,空间特异性 转录激活因子 转录抑制因子转录调节因子结构,DNA结合域结构模式,Helix-turn-helix 螺旋-转角-螺旋,第一个被确立的DNA-结合结构最常见DNA结合域之一常结合CAAT盒例：Lac阻遏蛋白,Trp阻遏蛋 白、分解代谢激活蛋白(CAP)等,Zinc-fingers 锌指,最常见DNA结合域之一约有30个AA残基 其中4个AA残基（2个Cys，2个His或4个Cys）配位键 Zn2+锌 指与DNA双螺旋大沟结合。常结合GC盒,1,2,3,4,5,6,7,8,9,蛋白质,一段肽链中每隔7个AA 即有一个Leu 螺旋 亲水面：亲水AA组成 疏水面：Leu组成（亮氨酸拉链条）可形成二聚体（发挥作用）（同二聚体/异二聚体）DNA的结合域：拉链区以外结构,Leucine-zippers 亮氨酸拉链,helix-loop-helix 螺旋-环-螺旋,两个-螺旋由很长的 连接区（环）相连形成二聚体有利于其与DNA结合,同源异形结构域（Homeodomains，HD）是一种编码60aa的序列，长180bp，它存在于很多控制果蝇早期发育基因中，在高等生物中也发现了相关基序。HD的C-端区域和原核阻遏蛋白的HTH同源，但也有不同:HD的C端由3个-螺旋构成，螺旋3结合于大沟，长 17aa；而阻遏蛋白由5个-螺旋构成，螺旋3长 仅9个 aa；原核的HTH的以二聚体形式与DNA结合，靶序列是回 文结构，而HD是以单体形式与DNA结合，靶序列 不是回文结构；HD N-端的臂位于小沟，而HTH螺旋1的末端与DNA的 背面接触,真核基因转录调节是复杂的、多样的,*不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式；,*多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。,*转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。,三、转录起始和加工的调节,（一）转录起始的选择 酵母蔗糖酶基因，有6个基因（Suc15,7）位于不同的染色体上。每一个基因都可以转录合成蔗糖酶，但有胞内酶和胞外酶两种不同形式。前者的合成不受葡萄糖存在的影响，但含量低；后者的合成受到葡萄糖的抑制。两种酶的结构相似，胞外酶仅多了信号序列，经切除后胞外酶比胞内酶在N-端仅多了一个Ser经分析发现Suc-2 基因有3个TATA框，但尚不清楚和2种酶的关系，也没有确定是否存在cAMP-CAP位点。,（二）选择性加工 即使是同一个基因，有相同的初始mRNA，但由于5端，内含子及3末端等选择的不同选择，使成熟的mRNA也不同，结果编码了功能不同的蛋白。不同5端的选择 选择不同的3端 选择不同外显子,5端的选择有的基因具有两个启动子区，每一区都有它自己的组织调控元件，那么两个长度不同的转录本将会产生组织特异性mRNA和蛋白产物。,选择不同的3端,选择不同外显子,第七节 翻译的调控,（一）mRNA翻译的控制（二）mRNA的结构和翻译的效率（三）翻译的起始调节（四）选择性翻译（五）反义RNA调控（六）翻译的自我调节,（一）mRNA翻译的控制,通常核糖体中的 rRNA和tRNA是很稳定的，而mRNA分子的稳定性很不一致，有的mRNA的寿命可延续好几个月，有的只有几分钟。在很多短寿命的mRNA 3端非翻译区（UTR）中的一组富含AU的序列（UUAAUUUAU）是和它们的不稳定性有关系的，但现在还不清楚AU丰富区怎样使mRNA不稳定的，可能和取消poly（A）有关；也可能AU序列与80S复合物形成过程中的某种因子结合。,（二）mRNA的结构和翻译的效率 5m7G帽结构是否存在和是否易于接近eIF-4F的程度 5端非翻译区的长度高级结构和高GC含量 mRNA 3端的poly(A),（三）翻译的起始调节在网织红细胞中有两个合成酶系，一个合成血红素，另一个合成珠蛋白，血红素通过自身的反馈调节来控制，而其浓度又可调节珠蛋白合成的速率，使珠蛋白合成速度为血红素的两倍，这种调控是通过控制翻译起始复合物的形成来进行的。,（四）选择性翻译,和珠蛋白的合成 在二倍体细胞中都有4个-珠蛋白基因，它们之间的浓度比应是：=2：1，而实际上是1：1 在无细胞系统中加入等量的mRNA和mRNA和少量的起始因子,结果合成的-珠蛋白仅占3%。当加入过量的起始因子时珠蛋白和珠蛋白 之比为1.4：1，接近1：1，表明翻译起始因子和两种mRNA的亲和性不同。,五小分子RNA的调控,反义RNA调控 1984年Adelman等发现大鼠的促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone,GnRH）的基因两条链都能转录，首次在真核中发现了反义RNA干扰RNA（RNAi）的调控 近年来的研究表明,一些小分子双链RNA通过特异性结合互补链，促使mRNA降解，从而特异地抑制体内特定基因的表达导致细胞表现出特定的基因缺失表型，引发转录后沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS），称为干扰RNA（RNA interference，RNAi）微小RNA(miRNAs)的调控 最近，在果蝇、线虫和Hela细胞中有大约100个新的22个碱基的微小分子RNA（microRNAs，miRNAs）被鉴定出来，就像lin-4 和 let-7，这些miRNAs是在RNA前体分子折叠成茎环二级结构后形成的，这些新发现的miRNAs被认为是在基因表达调控过程中起某种调节作用。,六翻译的自我调节,在真核生物中也存蛋白质合成的自我调节。例如微管蛋白是构成枋棰体的主要成分。而秋水仙碱和长春花碱都能抑制维管蛋白的多聚化，从而使细胞中游离的微管蛋白浓度增加。若在组织培养细胞中加入秋水仙碱或长春花碱侧会使微管蛋白的mRNA消失，如果用微量注射器将微管蛋白注入到哺乳动物细胞中，那么就会抑制微管蛋白的进一步合成。可能过量的微管蛋白结合于核糖体的新生蛋白上或结合于mRNA上，阻止翻译，导致mRNA的降解所致。,思考题,名词解释基因扩增、基因丢失、基因重排、基因家族、亮氨酸拉链模型、螺旋-环-螺旋、锌指结构简述DNA甲基化调控基因表达的基本原理简述X染色体失活及其可能机制简述转录因子的结构域模式,