真核基因表达的调控.ppt

1,13.真核基因表达的调控1,(Regulation of Eukaryotic Gene Exepression),Copyright 2012 by REN LINZHU.All rights reserved.,2,1 DNA水平的调控2 染色质水平上的基因活化调节3 转录水平的调控4 转录后水平的调控5 翻译水平的调控,内容介绍,3,4,5,原核生物操纵子，真核生物？,真核生物基因表达与调控的复杂性：（1）真核生物具有由核膜包被的细胞核，其基因的转录发生在细胞核中，而翻译则发生在细胞质中（2）真核生物基因数目比原核生物多，大多数基因除了不指导蛋白质合成的内含子，另外还有更多调节基因表达的非编码序列，真核生物所转录的前体mRNA必须经过加工成熟后才进入表达阶段。,6,真核生物基因表达与调控的复杂性,7,8,9,(3)真核生物染色质由DNA与5种组蛋白结合组成，它们折叠和缠绕形成核小体，核小体及染色质进一步折叠缠绕形成超级结构状态的细胞分裂中期染色体。染色质的结构对基因的表达起总体控制作用。,10,（4）化学信号包括某些激素的诱导控制作用。（5）基因组内DNA的化学修饰（6）发育过程中高度分化的机制,11,真核生物基因表达的调控可发生在不同水平上,12,真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。,13,The gene control region of a typical eucaryotic gene.,The promoter is the DNA sequence where the general transcription factors and the polymerase assemble.,14,1 DNA水平的调控,15,1.1 基因丢失在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因而去除其活性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化产生生殖细胞的那套染色体。例如在蛔虫胚胎发育过程中，有27DNA丢失。在高等动植物中，尚未发现类似现象。,DNA水平的调控：是真核生物发育调控的一种形式,它包括：基因丢失、扩增、重排等方式。,16,1.2 基因扩增,在没有发生细胞分裂，整条染色体几乎没有复制的情况下，细胞内某些特定基因的拷贝数专一性增加的现象.1.2.1 为满足正常的生长发育需要 如两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增:卵母细胞中的rDNA拷贝数比体细胞中增加了4000倍，用于转录合成卵裂期所需要的1012个核糖体。1.2.2 外界环境因素引起基因扩增 基因扩增与肿瘤形成及细胞衰老有关。在原发性的视网膜细胞瘤中，含myc 原癌基因的DNA区段扩增10-200倍。许多致癌剂可诱导DNA扩增。,17,1.3 基因重排:一个基因可以从远离其启动子的地方移到距它很近的位点，而被起动转录，这种方式称为基因重排。,特异性调节，发生在特殊的细胞类型中 例如：哺乳动物免疫球蛋白编码区的连接无序的，发生在肿瘤细胞基因组中,19,21,2 染色质水平上的基因活化调节,2.1 染色质结构影响基因转录 2.2 组蛋白的作用 2.3 转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加 2.4 DNA拓扑结构变化 2.5 DNA碱基修饰变化,22,23,（1）染色质结构影响基因转录：细胞分裂时松开分散在核内的染色质称为常染色质(euchromatin)，常染色质的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)，基因不能转录表达。原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活，可见紧密的染色质结构阻止基因表达。,24,25,常染色质:结构松散，基因表达异染色质:结构紧密，基因不表达有基因表达活性的染色质DNA对 DNase更敏感，即Dnase的敏感性可作为该基因的转录活性的标志。,26,（2）组蛋白的作用：早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。,组蛋白修饰,基因正常表达除了需要相应转录因子的诱导和启动子区处于低甲基化状态外，还需要具备另外一个表观遗传学条件，即组蛋白修饰处于激活状态。组蛋白对特定氨基酸的修饰可以间接提供某些蛋白的识别信息，然后通过蛋白质和染色质的相互作用改变染色质的结构，从而调控基因的表达。,组蛋白修饰主要是氨基端的甲基化修饰和(或)乙酰化修饰，特定组蛋白的氨基酸残基被甲基化和(或)乙酰化可以最终激活基因的表达，反之则抑制基因的表达。特定组蛋白羧基端的泛素化同样影响蛋白质的降解过程，从而也可调节基因的表达。目前研究还发现组蛋白修饰与CpG岛的甲基化密切相关。,组成核小体的组蛋白可以被多种化合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。,组蛋白的乙酰化和去乙酰化控制染色活性,组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。组蛋白H4的去乙酰化是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。HATs(histone acetytransferases)组蛋白乙酰化酶HDACs(histone deacetylases)HATs有两组，一组为A组，和转录有关；另一组是B组，和核小体装配有关。,辅激活因子可能有HAT乙酰化核小体组蛋白尾巴的活性,去乙酰化和基因活性的阻遏有关。在酵母中SIN3和Rpd3的突变将阻遏基因转变。SIN3和Rpd3与DNA结合蛋白Ume6形成复合物，而此复合物阻遏具有由Ume6 结合的URS1(上游阻遏序列)元件的启动子转录。Rpd3具有HDACs活性。,阻遏复合体含有3个成分：DNA结合亚基，辅阻遏物和组蛋白的去乙酰化酶,Pc-G蛋白不起始阻遏，但可维持阻遏,组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质(euchromatin)和有表达活性的基因相关联；而组蛋白的甲基化则与浓缩的异染色质(hetero-chromatin)和表达受抑的基因相关联。,组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。H3 Lys9甲基化最终导致了基因的沉默；然而，位于H3 Lys4的甲基化则与基因的活化相关联。,Histone Code,染色质蛋白并非只是一种包装蛋白，而是在DNA和细胞其他组分之间构筑了一个动态的功能平台。,40,（3）转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加：在核小体区DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNase 高敏感点(hypersensitive site)。这种高敏感点常出现在转录基因的5侧区(5 flanking region)、3末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近，该区域核小体的结构发生了变化，可能有利于调控蛋白结合而促进转录。,41,用DNAaseI来鉴别基因的活性,在成体的红细胞中，成体-球蛋白基因对DNAaseI的降解是高度敏感的，对胚胎-球蛋白基因是部分敏感的(可能是由于扩散效应)，但对卵清蛋白基因是不敏感的。,胚胎-球蛋白基因,成体-球蛋白基因,卵清蛋白基因,44,（4）DNA拓扑结构变化天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。,45,（5）DNA碱基修饰变化：真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,5-mC)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5侧区的CpG序列中，实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。DNA甲基化修饰途径存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。,DNA甲基化,DNA甲基化是指在甲基化酶的作用下，将一个甲基添加在DNA分子的碱基上。DNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状态。DNA甲基化的部位通常在CpG岛的胞嘧啶,47,DNA甲基化抑制基因转录的机理,用组蛋白Hl与含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA实验后发现：甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。,48,mCpG，即“CpG岛(CpG-rich islands)”甲基化(methylated)程度高，基因表达降低；去甲基化(undermethylated)：基因表达增加,在结构基因的调控区段，CpG二联核苷常常以成簇串联的形式排列。结构基因5端附近富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛(CpG islands)。CpG岛是CG二核苷酸含量大于50%的区域。CpG岛通常分布在基因的启动子区域。,CpG岛的甲基化会稳定核小体之间的紧密结合而抑制基因的表达。,51,DNA甲基化模式可以在DNA复制后被保持下来,肿瘤细胞的甲基化特点总体甲基化水平低局部甲基化水平高，即抑癌基因的甲基化水平高,基因组印记与DNA甲基化密切相关,1956年Prader-Willi综合征(Prader-Willi Syndrome,PWS)，患者肥胖、矮小、中度智力低下。染色体核型分析表明为 父源染色体15q11-13区段缺失。,1968年Angelman综合征(Angelman Syndrome，AS)，共济失调、智力低下和失语。母源染色体15q11-13区段缺失,PWS和AS综合症表明，父亲和母亲的基因组在个体发育中有着不同的影响，这种现象称为基因组印迹(genomic imprinting)。有些基因的功能受到双亲基因组的影响，即来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，打上了来源基因组的印记，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性。,基因组印迹是两个亲本等位基因的差异性甲基化型造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性(monoallelic activity)。,在PWS和AS患者中发现，微小染色体缺失集中的区域有成簇排列的富含CpG岛的基因表达调控元件，称为印迹中心(imprinting centers,ICs)。在父源和母源染色体上，这些调控元件的CpG岛呈现甲基化型的明显差异。,涉及到不同亲本来源的印迹基因的DNA甲基化型都是在生殖细胞成熟过程中建立的。,印迹基因的DNA甲基化型在生殖细胞成熟过程中的建立,原始性细胞（2n）,合子（2n）,配子（n）,迄今已发现的印迹基因已有150余个，大多成簇排列，其中许多是疾病基因。虽多数印迹基因的作用机制尚不清楚，然而几乎都与DNA甲基化型的异常相关联。,Cover LegendJust as the discovery of the Rosetta Stone in 1799 by Napoleons troops enabled Egytian hieroglyphics to be deciphered,mathematical bioinformatic techniques have allowed the imprint status of a gene to be predicted from cis-acting genomic motifs.This resulted in the genome-wide identification of genes in the human with high probability of being imprinted,and permitted the identification of candidate imprinted genes for complex human disorders where parent-of-origin inheritance is involved.Cover design by James V.Jirtle(Webwiz Design),65,3 转录水平的调控,真核生物细胞中有成千上万个基因表达，不同类型细胞由不同组合的基因表达。那么，每种细胞如何保证正确的基因组合表达？一种途径是基因重复：基因有多个拷贝，不同类型细胞表达不同的拷贝，不同拷贝的表达处于不同调控系统。另一种途径是复合控制系统：真核生物单拷贝基因转录调控系统,网络,66,3.1 真核与原核生物转录调控的区别,主要区别为：原核生物功能相关的基因常组织在一起构成操纵子，作为基因表达和调节的单元；真核生物基因不组成操纵子，每个基因都有其自身的基本启动子和调节元件，单独进行转录，但在相关基因之间也存在着协同调节，拥有共同顺式作用元件和反式作用因子的基因组成基因群(gene battery)；原核生物的调节元件种类较少，主要包括上游的启动区域调控元件和激活蛋白(activator)、以及阻遏蛋白(repressor)的结合位点；而真核生物的调节元件种类很多，包括上游调节元件，如组成型元件、增强子和沉默子以及反式作用因子如激活因子、阻遏因子等。它们由许多短的共有序列组成，能独立活化基因表达，在基因组中的许多中等重复序列也可作为调节元件；,67,无论是原核还是真核生物，其转录都受反式调节因子(转录激活因子或抑制因子)的调节。这类调节可在两个水平上进行：一是通过调节因子的生物合成(即对其种类和数量的调节)，其过程缓慢而持续，主要涉及到细胞的分化等；二是通过对它们进行构象转变或共价修饰(即对其活性的调节)。真核生物以正调节为主真核生物基因表达的调节因子主要以共价修饰为主，如磷酸化与去磷酸化的调节。真核生物具有染色质结构，基因活化首先需要改变染色质的状态，使转录因子能够接触并作用于启动子，称此过程为染色质改型(chromatin remodeling)。染色质水平的调节主要涉及真核生物发育与细胞分化等调节。,68,The gene control region of a typical eucaryotic gene.,The promoter is the DNA sequence where the general transcription factors and the polymerase assemble.,转录水平的调控,顺式作用元件(cis-acting element)反式作用因子(trans-acting factor)转录起始的调控,70,3.2 基因转录的顺式作用元件 cis-element,由若干可以区分的DNA序列组成，并与特定的功能基因相连，组成基因转录的调控区，通过与相应的反式作用因子结合，实现对基因转录的调控。按照功能分为启动子、增强子、沉默子按照调控水平分为基础转录水平的顺式作用元件，如启动子；特异诱导高效表达的顺式作用元件，如增强子,71,顺式作用元件(cis-acting elements):真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。发生在一个序列中的突变不会改变其他染色体上等位基因的表达.非编码序列,根据顺式作用元件所处的位置、在转录中的功能以及作用方式，可分为启动子(promoter)、增强子(enhancer)和沉默子(silencer)等。,3.2.1 顺式作用元件,72,顺式作用元件,73,3.2.2 启动子,启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。不同的启动子对RNA聚合酶的亲和力不同，所结合的反式作用因子（trans-acting factors）也不同，因此，基因转录活性也很不相同。至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。,74,哺乳类RNA聚合酶启动子中常见的元件,75,TATA盒：（TATAAAA）位置：-25-30bp是TFD结合位点。控制转录起始的准确性及频率。GC盒：（GGGCGG）CAAT盒：（GCCAAT）位置：-30-110bp 区域 决定基因表达的基础水平,与相应蛋白因子结合，提高或改变转录效率。,76,UPE:upstream promotor elementUAS:upstream activating sequence,77,78,(1)核心启动子(core promoter),是指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。包括转录起始位点及转录起始位点上游-25-30bp处的TATA盒。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录。,79,(2)上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或称上游激活序列（upstream activating sequence,UAS),包括通常位于-70bp附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)以及距转录起始点更远的上游元件等，能通过TFD复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的调控。,80,顺式作用元件,82,增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，而且具有组织特异性。它一般与转录激活因子结合，通过作用于转录起始复合物增强RNA聚合酶的活性，从而促进转录。增强子和启动子常交错覆盖或连续.病毒、植物、动物和人类正常细胞中都发现有增强子存在。作为基因表达的重要调节元件.,3.2.3 Enhancer sv40,83,增强子作用特点:,1.增强转录作用明显人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍!2.可位于基因组任何位置,没有基因专一性3.不具有方向性4.可远距离作用5.增强效应具有组织或细胞特异性,只有特定的蛋白质参与才发挥作用6.大多为重复序列,一般长50bp7.核心序列:(G)TGGA/TA/TA/T(G)8.许多增强子受外部信号调控,84,增强子的功能是可以累加的。SV40增强子序列可以被分为两半，每一半序列本身作为增强子功能很弱，但合在一起，即使其中间插入一些别的序列，仍然是一个有效的增强子。因此，要使一个增强子失活必须在多个位点上造成突变。对SV40增强子而言，没有任何单个的突变可以使其活力降低10倍。,感染真核细胞的病毒DNA，大多具有可被寄主细胞蛋白质激活的增强子。小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）的DNA，具有糖皮质激素基因的增强子。在能被类固醇激活的细胞（如乳腺上皮细胞）中，MMTV病毒能旺盛生长。病毒有寄主范围，因它有组织特异和物种特异的增强子。,87,3.2.4 silencer,负调控元件,不受距离和方向限制，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。对真核生物成簇基因的选择性表达起重要作用 例如 酵母，mating type-珠蛋白基因簇 T淋巴细胞激活所需要的CD4/CD8基因Sawada S.,1994,A lineage-specific transcriptional silencer regulates CD4 gene expression during T lymphocyte development.Cell 77:917-929对细胞亚型成熟过程中特异性的选择表达,88,3.2.5 Insulator 绝缘子,绝缘子(insulator)是近年发现的一类特殊顺式作用元件，它不同于增强子，其功能是阻止激活或阻遏作用在染色质上的传递，使染色质的活性限定于结构域之内。绝缘子两种特性:如果将一个绝缘子置于增强子和启动子之间，它能阻断增强子对启动子的激活作用.如果一个绝缘子在活性基因和异染色质之间，它能够提供一道屏障来保护基因防备异染色质延伸所带来的失活效应.这些性质说明绝缘子可能影响染色质的组织结构。,89,90,91,一些绝缘子同时具有上述两种特性,但其他的绝缘子只有一种特性,或者具有封阻功能,或者具有屏障功能.,用途:增强基因调控的准确性.,