真核基因的表达调控.ppt
第七章 真核基因的表达调控,原核细胞环境因素对调控起到决定性的作用。群体中每一个细胞对环境变化的反应是直接的和一致的。真核细胞基因表达调控最明显的特征是在特定时间，特定的细胞中特定的基因被激活，实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育，并使生物的组织和器官保持正常功能。这是生命活动规律决定的，环境因素在其中作用不大。,真核生物基因调控可分为两大类，第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降，或细胞周期不同阶段酶活性的调节；第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的进程。,根据基因调控发生的先后次序，可将其分为转录水平调控及转录后水平调控。后者又进一步分为RNA加工成熟过程的调控、翻译水平的调控及蛋白质加工水平的调控。诱发基因转录的信号、基因调控在哪一步(模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成)实现以及不同水平基因调控的分子机制是研究基因调控的三个主要内容。,1 真核生物的基因结构与转录活性,真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在的差异:(l)在真核细胞中，成熟mRNA为单顺反子mRNA，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。(2)真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。,(3)高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间存在不被翻译的内含子。(4)真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数，这种能力在原核生物中是极为鲜见的。5,(5)在原核生物中，转录的调节区很小，大都位于转录起始位点上游不远处；调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合。在真核生物中，基因转录的调节区则大得多，可能远离核心启动子达几百个甚至上千个碱基对。这些调节区也能与蛋白质结合，但并不直接影响启动子对RNA聚合酶的接受程度，而是通过改变整个基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合力。,(6)真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。原核生物中不存在这样严格的空间间隔。(7)许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。,1.1 外显子和内含子的可变调控,通常，一个基因的转录产物通过组成型剪接只能产生一种成熟mRNA。由于选择性剪接，有一些真核生物基因的原始转录产物可通过不同的剪接方式，产生不同的mRNA。一些核基因由于转录时选择不同的启动子，使mRNA表达水平发生极大的变化。,小鼠淀粉酶基因表达,由S外显子起始的转录物是由L外显子起始转录产物的100倍以上。,1.2 DNA水平上的基因表达调控,在个体发育过程中，DNA会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物的发育。成熟红细胞能产生大量的可翻译成熟珠蛋白的mRNA，它的前体细胞是不产生珠蛋白的。这种变化是由于基因的拷贝数发生了永久性变化所调控的。这样的DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，这包括基因丢失、扩增、重排和移位。这种调控使基因组发生了改变。10,开放型活性染色质结构引起转录,真核基因的活跃转录是在染色质上进行的。准备转录时，染色质在特定区域被解旋松弛，引起核小体结构和DNA局部结构的变化，并导致结构基因暴露，促进转录因子与启动子区DNA的结合，诱发基因转录。,暴露的DNA易受核酶的攻击，活跃表达基因所在染色质上含有DNA酶I超敏感位点，这些超敏感位点大多位于基因5端启动子区。非活性状态基因5端相应位点不表现对DNA酶I的超敏感性。,基因扩增,基因扩增为了满足某个阶段生长发育的需要，基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因活性调控的一种方式。例如，非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDNA）约500个拷贝。卵裂期和胚胎期，需要大量的rRNA，基因会大量复制rDNA，使拷贝数达到200万，扩增约4000倍。,13 DNA甲基化与基因活性的调控,DNA甲基化修饰途径存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。大量研究表明，DNA甲基化能关闭某些基因的活性。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。,DNA的甲基化,DNA甲基化修饰过程通过改变基因的表达，参与细胞的生长、发育过程及X染色体失活等的调控。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。15,DNA甲基化抑制基因转录的机理,用组蛋白Hl与含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA实验后发现：甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，影响蛋白质与DNA的相互作用；抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。,用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的，基因的5端和3端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。17,72 真核基因的转录调控,真核基因的调控主要也是在转录水平上进行的。具体方式是特定的反式作用因子(trans-acting factor，又称跨域作用因子)与顺式作用元件(cis-acting，element)相互作用而进行的。,7.2.1 顺式作用元件,真核生物启动子和增强子。它们由若干DNA序列元件组成，它们常与特定的功能基因连锁在一起。,1.启动子(Promoter),真核基因启动子由核心启动子和上游启动子两个部分组成，是在基因转录起始位点(+1)及其5上游大约100200bp以内的一组具有独立功能的DNA序列，是决定RNA聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件。20,(1)核心启动子(core promoter),是指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。包括转录起始位点及转录起始位点上游-25-30bp处的TATA盒。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录。,(2)上游启动子元件(upstream promoter element，UPE),包括通常位于-7Obp附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等，能通过TFD复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。,2.增强子及其对转录的影响,增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。病毒、植物、动物和人类正常细胞中都发现有增强子存在。作为基因表达的重要调节元件，增强子通常具有下列特性:,(1)增强效应十分明显 一般能使基因转录频率增加10200倍，有的可以增加上千倍。(2)增强效应与其位置和取向无关 不论增强子以什么方向排列(53或35)，甚至与靶基因相距3000bp或在靶基因下游，均表现出增强效应。(3)大多为重复序列 一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个产生增强效应时所必需的核心序列:(G)TGGA/TA/TA/T(G)。,(4)没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应。(5)许多增强子受外部信号的调控，如金属硫蛋白基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镐浓度做出反应。25,增强子的功能受DNA双螺旋空间构象的影响。增强子有如下3种作用机制:1.影响模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间成环连接，活化基因转录。2.将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶在DNA链上的结合和滑动。3.增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶进入染色质结构的 入口。,722 反式作用因子,参与调控靶基因转录效率的蛋白质，它们能识别或者结合在各类顺式作用元件核心序列上(如:上游调控元件或增强子区域)。这些因子有两种独立的活性:特异地与DNA结合位点相结合，然后激活转录。两种活性可以独立分配给特定的蛋白结构域，分别称作DNA结合结构域和激活结构域，两者是相分离的。它们在蛋白质的不同区域。,1 DNA结合结构域,1.螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix，H-T-H)结构 这一类蛋白质分子中有至少两个螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成“转折”，近竣基端的螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白质在DNA双螺旋大沟中的结合。与DNA相互作用时，同源域蛋白的第一、二两个螺旋往往靠在外侧，其第三个螺旋则与DNA大沟相结合，并通过其N-端的多余臂与DNA的小沟相结合。,2.锌指结构域,这种结构域有两种形式，C2H2型锌指通过2个半胱氨酸和2个组氨酸残基固定，这四个残基与锌离子在空间上形成一个四面体结构。这种锌指折叠形成一个紧密的结构，由二条链和一个-螺旋组成，-螺旋与DNA大沟结合。该-螺旋区域上含有保守的碱性氨基酸，负责与DNA的结合。另一锌指结构是锌离子与4个半胱氨酸结合，它出现在一百多种类固醇激素受体转录因子中。这些因子由同型或异型的二聚体组成，其中每一单体包含2个C4锌指结构。两个单体通过锌离子稳定折叠成更复杂的构象，再把每个单体的-螺旋插入到DNA的连续大沟中。30,3.碱性结构域,在许多DNA结合蛋白中都发现了碱性结构域，它通常是与亮氨酸拉链或HLH基序中的一个联合在一起的，结果被称做碱性亮氨酸拉链(bZIP)或碱性HLH蛋白。蛋白的二聚作用使二个碱性结构城相邻，进而可与DNA发生作用。,2 二聚体结构域,1.亮氨酸拉链 亮氨酸拉链的肽链上每相隔七个残基就会有一个疏水的亮氨酸残基，这些残基位于DNA结合域的C端-螺旋上，这样-螺旋的侧面每两圈就会出现一个亮氨酸，形成一个疏水的表面。结果在-螺旋的疏水表面间就可以互相作用，形成二聚体。这种相互作用形成一个卷曲的卷曲结构(coiled-coilstructure)。,bZIP转录因子包含一个碱性的DNA结合区域，其N端与亮氨酸拉链相连，这也可以被看作是-螺旋C端的延伸。每个-螺旋相连的碱性结构域形成一个对称的结构，沿DNA相反的方向延伸并与对称的DNA识别位点发生作用，最终像一个夹子夹在DNA上。亮氨酸拉链在一些利用DNA结合结构域的蛋白中也可以不通过碱性结构域而作为二聚体结构域使用，包括一些同源域蛋白。,2.螺旋-环-螺旋（HLH）结构域,这一结构在总体上与亮氨酸拉链相似，只是它的二个-螺旋被一个非螺旋的多肽环分成二个单体蛋白，C端-螺旋一侧的疏水残基可以二聚化。与亮氨酸拉链一样，HLH结构也经常与碱性结构域相邻，以形成DNA结合所需的二聚体。,7223 转录激活结构域,1.酸性激活结构域 通过比较酵母Gcn4和Gal4的转录激活结构域、哺乳动物糖皮质激素受体以及疤疹病毒激活子VPl6发现它们都含有很高比例的酸性氨基酸，这样的结构域被称作酸性激活结构域，且是许多转录激活结构域的特征。,2.富含谷氨酰胺结构域 富含谷氨酞胺的结构域是在转录因子SPl的二个激活区域上首次发现的。与酸性结构域一样，谷氨酰胺残基所占的比例很重要。3.富含脯氨酸结构域 在一些转录因子中所发现的富含脯氨酸结构域，与谷氨酰氨相似，有一个能激活转录的连续脯氨酸残基链。,7224 阻抑物结构域,转录的阻抑有可能是通过间接地对激活因子功能的干扰而实现的，有以下几种情况:阻断了激活因子的DNA结合位点(与原核生物的阻抑蛋白一样)。并非阻碍DNA结合而是掩盖了激活结构域。,哺乳动物甲状腺激素受体的结构域在缺少甲状腺激素的情况下可以阻抑转录，而在与配体结合后又可激活转录。Wilms癌基因WT1的产物是一个抑癌蛋白，这个抑癌蛋白就有一个特定的富脯氨酸阻抑结构域。,723 转录调控的对象,激活结构城多样性的存在给我们提出了一个问题，即在起始转录复合体中它们的调控对象是相同的还是不同的?酸性激活结构域可以从下游的增强子位点激活转录，而富含脯氨酸结构域的激活力很弱，富含谷氨酰氨根本无法激活;在酵母中富含脯氨酸的结构域和酸性结构域具有活性，而富含谷氨酰胺的结构域则没有活性，这些都表明激活结构域有着不同的调控对象。,不同的转录激活因子调控的对象是不一样的，可能的情况有以下几种:染色质结构;与TFD作用;与TFB作用;对TFH复合体的调整和作用。不同的激活结构域有着不同的调控对象，而且转录起始和延伸过程的任何组分或阶段都可能成为调控的对象，从而实现转录的多阶段调控。,724 转录调控实例,1.组成性转录因子:SPl SPl与一段富含GC的保守序列GGGCC沿相连，是一种组成性转录因子。SPl存在于所有的细胞类型中，包含3个锌指结构以及2个富含谷氨酰胺转录激活结构域。SPl的富含谷氨酰胺结构域与TAFll0发生特异性作用，而TAFll0与TATA结合蛋白（TBP)相结合组成TFD。这就是SPl如何调控起始转录复合体的一种方式。,2.激素调控:,类固醇激素受体 激素由一类细胞分泌，然后将信号转移给另一类细胞。如类固醇激素是脂溶性的，可以穿过细胞膜与被称作类固醇激素受体的转录因子相互作用。在没有类固醇激素存在的条件下，该受体与抑制蛋白结合，游离在细胞质中，对转录有阻抑作用。当类固醇激素与受体结合后，可以使受体从抑制蛋白上游离出来，然后受体二聚化，进而转移到细胞核中，转化为转录激活因子。,3.磷酸化调控:STAT蛋白,某些激素不穿过细胞，它们与细胞表面的受体结合，通过信号转导的过程将信号传递给细胞内的蛋白。如-干扰素通过激活JAK激酶，诱发转录因子（STATl）的磷酸化（当STATl没有磷酸化时，以单体的形成存在于细胞质中，没有转录活性）。它的一个特定酪氨酸残基发生磷酸化后，便能够形成同型二聚体，并从细胞质转移到细胞核中，进而激活在启动子处含有一保守DNA结合序列的目标基因的表达。,4.转录延伸：HIV Tat,HIV编码一种称为Tat的激活蛋白，该蛋白为HIV基因的大量表达所必需。Tat与RNA上的一段称为TAR的茎环结构结合（TAR是HIV RNA5端的转录起始点后的一段不翻译区域）。在哺乳动物细胞中Tat所起的主要作用表现在转录延伸的过程中，若没有Tat的存在，RNA聚合酶转录复合体将因进程过慢而使HIV的转录过早终止。,Tat可与RNA结合因子一起以复合体形式结合在转录物的TAR序列上，Tat-RNA复合体可以向后成环，并与装配在启动子处的新形成的转录起始复合体作用，这种作用导致TFH的激酶活性被激活，结果RNA聚合酶的羧基端结构域(CTD)实现磷酸化，使得RNA聚合酶前进，完成HIV转录单位的阅读，实现HIV蛋白的大量合成。,5.胚胎发育:同源域蛋白,同源框是一段保守的DNA序列，编码一种同源异型域的螺旋-转角-螺旋的DNA结合蛋白。果蝇同源异型基因编码的转录因子中的同源异型域负责身体各部分的正确分化。例如，同源异型基因中的一种Antennapedia的突变可使果蝇在应该长触角的地方长出腿来。,73 转录后的基因调控,转录调节是基因表达调控的最重要方式，但还有其他方式。基因表达的过程中可能被调控，步骤越多产生调控的形式也会越多。真核生物转录之后到达翻译的路比原核生物长，所经步骤也多，因此，基因的转录后调控就显得更为重要。RNA的加工成熟和蛋白质合成，在真核基因调控中起着重要作用。,731 mRNA加工成熟过程中的调控,编码蛋白质的基因转录时首先生成前体pre-mRNA(或称hnRNA)，然后再加工剪接为成熟有生物功能的mRNA。这些加工主要包括在mRNA的5末端加“帽子”，在其3末端加上poly(A)，进行RNA的剪接以及核苷酸的甲基化修饰等。由于hnRNA被不同的加工会产生不同mRNA，它作为蛋白质合成模板的功能就会不同，所以mRNA的加工成熟是基因表达的重要调控环节。,1、复杂转录单位对调控的影响,一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因含有复杂转录单位，它们除了含有数量不等的内含子以外，其原始转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的mRNA。(1)利用多个5端转录起始位点或剪接位点产生不同的蛋白质。下图说明肌球蛋白碱性轻链基因选用了不同的5转录起始位点及剪接不同外显子产生蛋白质异构体LCl和LC3的过程。,(2)利用多个加poly(A)位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质。这类基因调控点在于有两个或多个加poly(A)位点，可通过不同的剪接方式得到不同的蛋白质。例如大鼠降钙素基因就是如此。,2、mRNA有效性的调控,真核生物能否及时、长时间利用成熟的mRNA翻译出蛋白质，与mRNA的稳定性相关。原核生物mRNA的半衰期平均大约3min。高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均约为3h。在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达十几天，加上强启动子的多次转录，使一些终端细胞特有的蛋白质合成达到惊人的水平。,1112,例如，家蚕丝心蛋白基因具有很强的启动子，几天内即可转录出105个丝心蛋白mRNA，而它的寿命长达4天，每个mRNA分子能重复翻译出105个丝心蛋白，所以4天内可产生1010个丝心蛋白，说明mRNA寿命的延长是mRNA有效性的一个重要因素。,732 翻译水平的调控,在高等真核生物中转运铁蛋白受体（TfR）和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒。这两个mRNA上存在相似的顺式作用元件铁应答元件(iron responsive element，IRE)，IRE与IRE结合蛋白(IREBP)相互作用控制了这两个mRNA的翻译效率。当细胞处于缺铁或高铁水平时，能产生两个数量级的蛋白水平差异，却没有在mRNA水平上发现存在显著差异。,研究表明，位于5非翻译区的IRE控制了铁蛋白mRNA的翻译效率，去掉这个非翻译区IRE，可造成铁蛋白的永久性高水平翻译。当细胞缺铁时，IREBP与IRE具有高亲和力，两者的结合有效地阻止了铁蛋白mRNA的翻译。与此同时，TfR mRNA上3非翻译区中的IRE也与IREBP特异结合，有效地阻止TfR mRNA的降解，促进TfR蛋白的合成。,催乳素能明显延缓酪蛋白(casein)mRNA的降解。不加入催乳素时，体系中的酪蛋白mRNA在1小时内降解50%，而加入催乳素后40小时，酪蛋白mRNA才降解50。这就是说，催乳素能调节酪蛋白mRNA有更多机会进行翻译，产生更多的酪蛋白。,4、可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控,许多可溶性蛋白因子(起始因子)，对蛋白质合成的起始有着重要的作用，对这些因子的修饰会影响翻译起始。例如：eIF-2磷酸化对翻译起始的影响:用兔网织红细胞粗提液研究蛋白质合成时发现，如果不向这一体系中添加氯高铁血红素，几分钟之内蛋白质合成活性急剧下降，直到完全消失。这是由于没有氯高铁血红素存在时，网织红细胞粗提液中的蛋白质合成抑制剂会被活化，从而抑制蛋白质合成。,抑制剂（HCI）是eIF-2的激酶，可以使eIF-2的亚基磷酸化，从而由活性型变成非活性型。氯高铁血红素能够阻断HCI的活化过程。eIF-2的亚基磷酸化以后，影响了蛋白质合成起始复合物的生成。,在蛋白质生物合成的过程中，特别是在起始反应中，mRNA的可翻译性是起决定作用的，其5末端的帽子结构、二级结构、与rRNA的互补性以及起始密码附近的核苷酸序列都是蛋白质生物合成的信号系统。蛋白质生物合成的调控，就是通过mRNA本身所固有的信号与可溶性蛋白因子或者与核糖体之间的相互作用而实现的。,思考题,1、说明外显子、内含子在一个基因中结构特征。2、增强子是什么？阐述其作用机制。3、原核细胞与真核细胞基因表达调控最明显的区别在哪里？4、反式作用因子与顺式作用元件物质本质是什么？顺式作用元件与反式作用因子的分子机理如何？,
