疫学所有实验.ppt
第二十一章 免疫学检测原理,免疫学检测乃借助免疫学、细胞生物学和分子生物学理论或技术，对抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子等进行定性或定量检测。免疫学检测技术在医学生物学研究领域得到广泛应用，并在临床实践中用于探讨免疫相关疾病的发病机制及其诊断、病情监测与疗效评价等。随着现代免疫学以及细胞生物学、分子生物学等相关学科的进展，免疫学检测技术不断发展和更新。第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法第二节 免疫细胞的检测第三节 免疫分子的检测,学习指导,1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念2、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称3、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用4、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用,第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法,一、抗原抗体结合反应的特点（熟悉）（一）特异性和交叉反应（二）抗原-抗体结合的带现象与可见性抗体反应中，可能出现抗原或抗体过剩的情况，由于过剩一方的结合价不能被完全占据，多呈游离的小分子复合物形式，或所形成的复合物易解离，不能被肉眼察见，此为前带现象（prozone）即抗体过剩，或后带现象(postzone)即抗原过剩。（三）可逆性抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。,第一节 二、抗原-抗体反应的影响因素（熟悉）,（一）电解质（二）酸碱度抗原抗体反应的最适pH是68。（三）温度 抗体-抗原反应的最适温度为37。（四）抗原和抗体的性质抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。抗原和抗体的浓度、比例对抗原-抗体反应的影响最大，是决定性因素,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（一）凝集反应（图21-1）（掌握）细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为凝集反应(agglutination)。1直接凝集 2间接凝集 3间接凝集抑制试验,各种凝集反应示意图,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（二）沉淀反应（掌握）可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋白分子等）与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀，此为沉淀反应(precipitation)。1单向免疫扩散(single immunodiffusion)2双向免疫扩散(double immunodiffusion)3免疫电泳(immunoelectrophoresis)4免疫比浊(immunonephelometry),单向免疫扩散(single immunodiffusion),双向免疫扩散(double immunodiffusion),免疫电泳(immunoelectrophoresis),对流免疫电泳,火箭免疫电泳,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（三）补体参与的反应（了解）应用抗体与红细胞表面抗原结合，激活反应体系中的补体成分，根据溶血现象判定试验结果。补体结合试验和溶血空斑试验（后叙）均属此类反应。补体结合试验曾用于检测多种细菌、病毒的抗原或抗体，因易受多种试验条件影响，已渐被其他方法取代。此外，补体依赖的微量细胞毒实验曾用于HLA的血清学分型，方法是：将标准分型血清与待检淋巴细胞反应，再加入兔补体，若细胞表面表达相应HLA抗原，则被溶解。溶解细胞可被台盼蓝或伊红染料着色，而活细胞不着色，藉此判定结果。,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术（熟悉）免疫标记技术（immunolabelling technique）乃用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术1免疫荧光法(immunofluorescence，IF)此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。（1）直接荧光法：（2）间接荧光法：,免疫荧光法(immunofluorescence，IF),第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术2酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA)（1）酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)：是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。其基本方法是：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中游离成分分离（图21-6）。ELISA的操作方法很多，以下简介几种基本方法。,第一节 基本检测方法-（四）免疫标记技术,1）双抗体夹心法：2）间接法：3)酶联免疫斑点试验(ELISPOT):其原理是：4）BAS-ELISA：ELISA技术的优点是灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等,间接法,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术（2）免疫组化技术(immunohitochemistry techenique)：应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。常用技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术3放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术4化学发光免疫分析 将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。,第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法,（四）免疫标记技术5免疫印迹法(immunoblot)该法又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原（图21-10）。,第二节 免疫细胞的检测,一、免疫细胞及其亚类计数（了解）（一）外周血单个核细胞的分离体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。,第二节 一、免疫细胞及其亚类计数（了解）,（二）淋巴细胞亚群的分离 1尼龙棉分离法2E花结分离法 3洗淘法4流式细胞术(flow cytometry，FCM)5磁分离技术,第二节 一、免疫细胞及其亚类计数,（三）淋巴细胞亚群计数1免疫荧光技术 2微量细胞毒试验 在补体存在下，针对淋巴细胞CD分子的McAb与相应CD分子结合，可激活补体而使细胞溶解，通过活细胞和死细胞对染料着色的不同，即可判断待检细胞是否表达特定CD分子，从而对淋巴细胞亚群进行计数,第二节 二、淋巴细胞功能测定（了解）,（一）淋巴细胞功能测定的体外试验1.淋巴细胞增殖试验（1）3H-TdR掺入法：（2）MTT法：（3）形态学计数法：,第二节 二、淋巴细胞功能测定（了解）,2细胞毒试验 CTL、NK细胞可直接杀伤不同靶细胞（如肿瘤细胞、移植供体细胞等）。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。（1）51Cr释放法：（图21-11）。（2）乳酸脱氢酶（LDH）酶释放法：（3）细胞凋亡检查法：,第二节 二、淋巴细胞功能测定,3分泌功能测定（了解）（1）细胞因子分泌细胞的测定：（2）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验(hemolytic plaque assay)，即测定针对SRBC表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其原理是：抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数（图21-12）。亦可采用RHPA和ELISPOT法检测抗体分泌细胞。图21-12 溶血空斑试验,第二节 二、淋巴细胞功能测定,（二）淋巴细胞功能测定的体内试验（了解）正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应，细胞免疫低下者呈阴性反应。皮肤试验方法简便，可辅助诊断某些病原微生物感染（结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等。皮肤试验常用的生物性抗原多从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶-链道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。,第三节 免疫分子的检测,一、免疫球蛋白的测定（了解）免疫球蛋白的测定有两类方法：在体外用已知抗原检测相应抗体，用于多种感染性疾病的辅助诊断与流行病学调查（前已述及）；用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定。检测血清含量高的IgG、IgA、IgM时，可用免疫比浊法；检测IgD、IgE选用ELISA、RIA等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法,第三节 二、补体测定（熟悉）,测定血清补体含量与活性有助于了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助ELISA、RIA等方法。血清总补体活性测定常采用50%补体溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致SRBC溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果，通常以50%溶血所需的最小补体量表示总补体活性,第三节 三、细胞因子检测（了解）,细胞因子检测可分为免疫学测定法、生物学活性测定法及分子生物学测定法。（一）免疫学测定法1分泌性细胞因子检测 常用方法为双抗体夹心法、ELISA、免疫斑点法、放射免疫法（RIA）、ELISPOT、免疫印迹法等。某些细胞因子含量甚微的样品（如脑脊液）可用免疫聚合酶链反应（immuno-PCR）。2胞内细胞因子检测 采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同细胞因子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的细胞因子，也可用多参数流式细胞术对胞内多种细胞因子进行检测。,第三节 三、细胞因子检测,（二）生物活性测定法1促进细胞增殖和增殖抑制法2抗病毒活性测定法3直接杀伤法4趋化活性测定法 此外，某些细胞因子能诱导靶细胞表达某些膜分子或可溶性蛋白质，可用荧光素标记抗体检测表达相应分子的细胞数，或测定细胞所分泌的蛋白质，间接了解细胞因子活性。,第三节 三、细胞因子检测,（三）分子生物学测定法具体方法为聚合酶链反应（PCR）、实时定量PCR、RNA印迹法、核酸酶保护分析法和原位杂交法等，例如：根据细胞因子基因核苷酸序列设计相应引物，借助逆转录PCR测定待检细胞中特异性mRNA。,第三节 四、CD分子、表面受体和黏附分子的检测（了解）,检测细胞表面CD分子、表面受体和黏附分子可用于鉴别免疫细胞及其亚类，并了解其分化、活化状况。用已知的抗CD分子、表面受体或黏附分子抗体可鉴定细胞表面相应膜分子，常用的方法有间接免疫荧光法、流式细胞术等。某些CD分子、受体分子和黏附分子还存在可溶性形式，可采用ELISA等免疫学方法测定其含量。,第三节 五、HLA型别分析（了解）,以往主要借助血清学和细胞学方法进行HLA型别分析，目前基因分型已成为主流技术，常用者为指纹图谱技术、聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）、单核苷酸多态性分析（SNP）等。HLA分型技术在同种移植供、受者配型、亲子鉴定和某些疾病研究中已被广泛应用。,本章小结,1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念2、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称3、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用4、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用,
