生物化学第二章核酸化学.ppt

第二章 核酸化学,Nucleic Acids,第二章 核酸的化学,核酸的概念和重要性,核酸的组成成分,DNA的结构,DNA和基因组,RNA的结构和功能,核酸的性质,核酸的序列测定,第一节 概 述,核酸(nucleic acid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid)核糖核酸,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年的某天瑞士的生物化学家米歇尔(Miescher)研究一个病人的绷带，小心地将绷带上粘着的病人伤口处的物质洗下来。洗脱物中含有许多脓细胞。他向其中加入酒精，将细胞中的脂肪类物质除去，之后又加入含有胃蛋白酶的提取液清除各种杂蛋白，这样，他就可以拿到纯的浓细胞的细胞核了。于是米歇尔开始研究这些核。结果他意外地发现核中有一种从未认识到的新物质，并起名为“核素”。这就是现在我们知道的DNA。经过后人的研究，核素为酸性物质，含有三种成分：糖、磷酸、有机碱。又发现糖少了一个氧。称之为脱氧核糖。,米歇尔的发现,哪些人用什么方法最终证明了遗传的物质基础是DNA呢？,1.格里菲斯经典转化实验（1928）及埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂等人的转化补充实验（1941）。2.赫西和蔡斯大肠杆菌T2噬菌体感染大肠杆菌实验。,格里菲斯肺炎双球菌转化实验,将R型活菌注入小鼠体内,一段时间后,将S型活菌注入小鼠体内,一段时间后,将杀死的S型菌注入小鼠体内,一段时间后,将R型活菌与杀死的S型菌注入小鼠体内,一段时间后,细菌发生转化，性状的转化可以遗传。,埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂转化补充实验,从S型肺炎球菌活体上取得蛋白质、荚膜、DNA、RNA，分别与R型肺炎球菌混合后注入到小白鼠体内，结果被注入DNA的小白鼠死亡，其它小白鼠存活。,DNA是遗传物质,只有DNA引起R型肺炎球菌转化,赫西和蔡斯实验噬菌体侵染细菌的实验,用放射性同位素35S标记外壳蛋白质,细菌内无放射性,用放射性同位素32P标记内部DNA,细菌内有放射性,DNA是真正的遗传物质,DNA主要的遗传物质,注：DNA不是唯一的遗传物质，较少的微生物也靠RNA进行遗传。,二、核酸的分类及分布、功能,(deoxyribonucleic acid,DNA),(ribonucleic acid,RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。,主要存在于细胞质中,携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,从DNA转录遗传信息，并指导蛋白质的合成。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,第二节 核酸的组成,元素组成,主要元素组成：C、H、O、N、P(911%),与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱基三部分构成,5-磷酸核苷酸的基本结构,（N=A、G、C、U、T）,H,H,(O)H,1,2,N,OH,CH2,H,H,5,4,3,P,O-,O,O,O-,核糖,磷酸,碱基,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,(一)、戊糖,(二)组成核酸的碱基,腺嘌呤Adenine,组成核酸的碱基,鸟嘌呤guanine,组成核酸的碱基,尿嘧啶uracil,组成核酸的碱基,胞嘧啶cytosine,组成核酸的碱基,胸腺嘧啶thymine,碱 基,碱基的结构特征,碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式烯醇式或胺式亚胺式互变异构。,酮式烯醇式互变异构,胺式亚胺式互变异构,(三)、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,腺 苷,尿苷,OH,假尿苷（）,假尿苷（）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷 X二氢尿嘧啶核苷 D取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷 m7G,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,2、稀有核苷酸：稀有碱基/核苷/核苷酸,3、核苷酸的其他形式,多磷酸核苷（NDP、NTP),环化核苷酸（cAMP、cGMP等）,辅酶或辅基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP），,活性代谢物（UDPG、CDP-胆碱，等）,1、核苷酸的组成：含氮碱基、戊糖和磷酸。,（四）核苷酸nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷酸和5-磷酸-核糖核苷酸。核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,1 核苷酸的组成,常见（脱氧）核苷酸的结构和命名,鸟嘌呤核苷酸（GMP）,尿嘧啶核苷酸（UMP）,胞嘧啶核苷酸（CMP）,腺嘌呤核苷酸（AMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,2.稀有核苷酸,修饰成分,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,3 核苷酸的其他形式,ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。它的结构如下：,（1）ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸),P,-O,腺苷-5-磷酸,O,ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时,可以释放出大量自由能。ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸),GTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP 类似的结构,也是一种高能化合物。GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下,ATP 和 GTP 可以相互转换。,（2）cAMP 和 cGMP,cAMP(3,5-环腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP(3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键。在 pH 7.4 条件下,cAMP 和 cGMP 的水解能约为43.9 kj/mol，比 ATP 水解能高得多。,环化磷酸化,cAMP,cGMP,（3）辅酶或辅基,作为核酸的单体:各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用：,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,第二信使cAMP,酶的辅助因子的结构成分（如NAD）,(五)核苷酸的连接方式,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA链；由核糖核苷酸聚合而成的则称为RNA链。,核酸分子中核苷酸之间的共价键,3-5 磷酸二酯键,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,在多聚核苷酸（DNA或RNA）链中，由于构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构也可表示为：,在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化为：5PAPCPGPCPTPGPTPA 3 或 5 ACGCTGTA 3,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,概 述,核酸(nucleic acid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid)核糖核酸,元素组成,主要元素组成：C、H、O、N、P(911%),与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱基三部分构成,核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,尿苷,OH,假尿苷（）,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷酸和5-磷酸-核糖核苷酸。核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,核苷酸的组成,核苷酸的连接方式,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA链；由核糖核苷酸聚合而成的则称为RNA链。,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,第三节 核酸的分子结构,一、一级结构（primary structure）,一级结构是指DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。,1、核苷酸的连接方式：3,5磷酸二酯键,2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链,信息量：4n末端：5 端、3端多核苷酸链的方向：5端3端(由左至右),3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写,DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,字母式,线条式,结构式,DNA一级结构的表示法,二、DNA的二级结构双螺旋模型(double helix model),1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,碱基组成分析Chargaff 规则：A=T；G C,电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。,DNA纤维的X-线衍射图谱分析,1.DNA双螺旋结构的研究背景,Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有相似的X射线衍射图谱。,碱基组成规则(Chargaff规则),A=T，G=C；A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等),不受年龄、营养、性别及其他环境等影响,Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在年总结出DNA碱基组成的规律：,沃森（左）和克里克与DNA分子双螺旋结构模型(1953年),2.DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链的方向为3端5端。,（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直，糖环平面与螺旋轴基本平行。,（3）螺旋直径约为2nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm。,（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,（5）螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。（6）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,碱基堆积力 是碱基对之间在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子层层堆积，分子内部形成疏水核心,双螺旋结构模型(B-DNA),（1）反平行双链：右手螺旋,脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧,碱基对平面垂直纵轴（2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）（3）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列 的基础（5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持 螺旋纵向稳定,DNA的双螺旋结构的形成,3.DNA双螺旋的构象类型,B-DNA：92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson 和Crick提出的模型相似。,A-DNA：75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录时发生BA。其碱基平面倾斜20，螺距与每一转碱基对数目都有变化。,Z-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约1.8nm，螺距4.5nm，每一转含12个bp，只有小沟。B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。,C-DNA：4446%相对湿度，螺距3.09nm，每转螺旋9.33个碱基对，碱基对倾斜6。可能是特定条件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。,D-DNA：60%相对湿度，DNA中A、T序列交替的区域。每个螺旋含8个bp，螺距2.43nm，碱基平面倾斜16。,DNA双螺旋的不同构象,双螺旋DNA的结构参数,DNA的双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,DNA分子间的三链结构,DNA二级结构的多样性,DNA回文序列及几种结构形式,回文序列,发夹式结构,十字形结构,中心区域,夫妻相思 宋朝.李禺 夫想妻（顺读）妻想夫（倒读）枯眼望遥山隔水，儿忆父兮妻忆夫，往来曾见几心知。寂寥长守夜灯孤。壶空怕酌一杯酒，迟回寄雁无音讯，笔下难成和韵诗。久别离人阻路途。途路阻人离别久，诗韵和成难下笔，讯音无雁寄回迟。酒杯一酌怕空壶。孤灯夜守长寥寂，知心几见曾来往，夫忆妻兮父忆儿。水隔山遥望眼枯。,三 DNA的三级结构,双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等,其中超螺旋是最常见的三级结构。,生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA某些噬菌体DNA某些细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA,环形DNA的不同构象 松驰环、解链环、负超螺旋（1）松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）解链环形DNA线形DNA拧松后再环化,（3）正超螺旋与负超螺旋DNA线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。,DNA超螺旋结构的形成,超螺旋状态的定量描述,公式1：L=T+W L连环数（linking number），DNA双螺旋中一条链以右手螺旋与另一条链缠绕的次数。TDNA分子中的螺旋数（twisting number）W超螺旋数或缠绕数（writhing number）,DNA超螺旋的形成,超螺旋的拓扑学公式：L=T+W或=+,DNA超螺旋结构形成的意义,使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中；推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,DNA在真核生物细胞核内的组装,核小体(nucleosome)：由DNA和组蛋白构成。,DNA：以超螺旋缠绕在组蛋白八聚体上,组蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4各两分子对称聚集成组蛋白八聚体,H1组蛋白在核小体之间,组蛋白与DNA的结合,染色体包装的结构模型,多级螺旋模型压缩倍数 7 6 40 5（8400）DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装,真核 双链线性DNA（dsDNA）,第四节、DNA与基因组,DNA,Transcription,RNA（mRNA、tRNA、rRNA）,Translation,Protein,基因,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。,结构基因,调节基因,基因组,（一）DNA与基因(gene),（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部基因的总和。,各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,（二）原核生物基因组的特点,1.DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。,2.功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中。,3.有基因重叠现象。,（三）真核生物基因组的特点,1.重复序列,单拷贝序列,：在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。,中度重复序列,：在DNA中可重复几十次到几千次。,高度重复序列,：可重复几百万次,2.有断裂基因,mRNA,1 872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,：由于基因中内含子的存在。,例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子。,DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,第五节 RNA的结构与功能,RNA分子是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。,信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用；核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所；转移RNA（transfer RNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,RNA的一级结构,RNA分子中各核苷酸之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构,RNA与DNA的差异 DNA RNA糖 脱氧核糖 核糖碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基 含稀有碱基,RNA的结构特点,RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分.,一、tRNA(转移RNA,Transfer RNA),占RNA总量的15一种氨基酸对应最少一种RNA,分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都具有CpCpAOH的结构。,*tRNA的一级结构特点 含 1020%稀有碱基，如 DHU 3末端为-CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC,双氢尿嘧啶(DHU),假尿嘧啶(),次黄嘌呤(I),DNA的双螺旋结构的形成,双螺旋结构模型(B-DNA),（1）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧（2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱 基对平面垂直纵轴（3）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列 的基础（5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持 螺旋纵向稳定,tRNA分子量为4S，1965年Holley 测定AlatRNA一级结构，提出三叶草二级结构模型。,主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TC环含有TC序列；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,tRNA 的结构,(1)氨基酸接受区包含有tRNA的3-末端和5-末端，3-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A的-OH可与氨基酸成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。(2)反密码区与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码子,(3)二氢尿嘧啶区该区含有二氢尿嘧啶。(4)TC区该区与二氢尿嘧啶区相对，各种tRNA在此区均含有TC。(5)可变区位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA该区变化较大。,酵母tRNA Ala 的二级结构,3,5,tRNA的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型。,*tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,1、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对,2、5端一般为鸟嘌呤核苷酸，3端为CCA-OH3。,3、二级结构为“三叶草”型（cloverleaf pattern）,小结,反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗传密码，称为反密码子（anticodon）。,氨基酸臂：3末端的CCA-OH3单链用于连接该tRNA转运的氨基酸。,二氢尿嘧啶环（DHU）：识别氨酰-tRNA合成酶,TC环：识别核蛋白体（核糖体）,4、“倒L”型三级结构,二.rRNA(核糖体RNA),约占全部RNA的80%，与蛋白质共同组成核糖体,是核糖核蛋白体的主要组成部分。rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。,Ribosome RNA,核蛋白体的组成,原核生物核糖体组成,真核生物核糖体组成,rRNA的分子结构,特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5sRNA的二级结构,Ribosomal RNA,16SrRNA,三.mRNA(信使RNA),约占总RNA的5%。不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核糖核蛋白体。,Messenger RNA,（一）信使RNA的结构与功能,*真核生物mRNA的结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNmp,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,内含子(intron),外显子(exon),*真核生物mRNA成熟过程,*mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,四 其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs,snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA,ncRNA)。,功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。,种类：核内小RNA；核仁小RNA；胞质小RNA；催化性小RNA；小片段干涉 RNA,snRNA（small nucleic RNA 核内小RNA）scRNA（small cytoplasmic RNA）asRNA（antisense RNA）,snRNA主要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.11%，与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。,asRNA可通过互补序列与特定的mRNA结合，抑制mRNA的翻译，还可抑制DNA的复制和转录。,小片段干扰RNA（siRNA；又称“引导RNAs”，guide RNAs）：一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。,First,the dsRNAs get processed into 20-25 nucleotide(nt)siRNAs by an RNase III-like enzyme called Dicer(initiation step).Then,the siRNAs assemble into endoribonuclease-containing complexes known as RNA-induced silencing complexes(RISCs),unwinding in the process.The siRNA strands subsequently guide the RISCs to complementary RNA molecules,where they cleave and destroy the cognate RNA(effecter step).,长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。,核酶（ribozyme）,催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。,催化性RNA(ribozyme)作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。,RNA在DNA复制、转录、翻译中均有一定的调控作用，与某写物质的运输与定位有关。,核酶在医学上的应用,1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-基因表达，并率先进入临床期。3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学:,第六节 核酸的理化性质,一、一般理化性质,1核酸的两性性质及等电点与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。核酸通常表现为酸性，电泳行为泳向正极（pH7-8）,2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有机溶剂。,3.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。,4.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。,5.利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。,加热条件下，D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色,分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S）,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）。蛋白质的紫外吸收峰在280nm,二、核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,三.双螺旋结构的稳定因素,（1）氢键；（2）碱基堆积力（base stacking force）由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子（如Na+、K+和Mg2+）中和，降低了DNA链之间的排斥力。,四、核酸的变性,1.变性稳定核酸双螺旋氢键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加变性因素 pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度 加热,DNA的变性过程,加热,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,增色效应（hyperchromic effect）：核酸变性时，其溶液OD260（260nm的紫外呼吸值）增高的现象。（DNA值增加2540%，RNA约增加1.1%。RNA本身只有局部的双螺旋区）,DNA的紫外吸收光谱,天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值,123,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,熔解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为熔解温度（Tm）或解链温度、变性温度。,2.实验室常用的方法热变性,影响Tm的因素：,（1）G-C的相对含量 GC含量越高，Tm越大（G+C）%=（Tm 69.3）2.44,（2）介质离子强度低，Tm低。,（3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。,（4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。,影响Tm值的因素,溶液的性质,DNA的性质和组成,大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线,五、DNA复性,DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,减色效应（hypochromic effect）:DNA复性时，其溶液OD260降低。,DNA复性,影响复性速度的因素：,（1）单链片段浓度,（2）单链片段的大小,（3）片段内重复序列的多少,（4）溶液离子强度的大小,（5）溶液温度的高低（退火温度Tm25）,六 分子杂交(hybridization),：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。,探针(probe)：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。,原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。,点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。,Southern印迹法（Southern boltting）：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法（Northern boltting）：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用:研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础,核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,Blotting the DNA from the gel to a membrane,Southern blotting,核酸的变性、复性和杂交,变性：在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。复性：在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。,第七节核酸的核苷酸序列测定,一、化学裂解法利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。,二、酶法(合成终止法),Sanger测定DNA核苷酸序列的方法：DNA合成终止法（双脱氧DNA链合成终止法）。,DNA sequencingThe Sanger dideoxy chain termination method,Dideoxynucleotidesterminate enzymatic synthesis of DNA.,ddNTP,Anneal oligonucleotide primer to template strand.,Add DNA polymeraseAll 4 dNTPs,ddTTP ddCTP ddGTP ddATP,Divide reaction mixturebetween 4 tubes,each of whichcontains a different ddNTP.,模板,引物,GGC,GGCC,GGCCATC,C,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,ddATP,A,GGCCATCG,GGCCATCGTTG,G,ddGTP,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,T,ddTTP,Automated DNA sequencing,Method 1:Four reactions/one gel“G”black labeled primer,has ddGTP“T”red labeled primer,has ddTTP“A”green labeled primer,has ddATP“C”blue labeled primer,had ddCTP,Method 2:one reaction/one gelddNTPs are labeled with different colored fluorescent tags,人类将进入生物经济时代,基因操纵生命的工具基因组潜藏着巨大的经济价值基