生化反应工程酶促反应动力学.ppt

,第二章 酶促反应动力学,酶促反应动力学在生物反应工程中的地位,生物反应动力学生物反应器生物反应过程的放大与缩小,酶促反应动力学微生物反应动力学废水生物处理反应动力学,生物反应工程的研究内容包括哪些？,2.1 酶促反应动力学的生物学基础,酶的基本概念,什么是酶？酶是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂。,“经典”酶学理论：酶蛋白质。,部分RNA也具有生物催化能力，通常称之为“核酶”。,1982年，美国T.Cech等人发现四膜虫的RNA有催化活性，具有自身切接能力。,核酶的数量少，多作用于核酸。,2.1.1.1 酶的分类,根据国际酶学委员会的规定，按照酶进行催化反应的类型，可将酶分为6类：,1.氧化还原酶（oxidoreductases）：羰基还原酶；2.转移酶（transferases）：氨基转移酶；3.水解酶（hydrolases）：腈水解酶；4.裂合酶（lyases）：丙酮酸脱羧酶；5.异构酶（isomerases）：葡萄糖异构酶；6.转接（或合成）酶（ligases)：T4 DNA转接酶。,蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶？,2.1.1.2 酶的功能,酶的催化共性：a、降低反应的活化能；b、酶可改变反应速率；c、不改变反应的平衡常数。,2.1.1.2 酶的功能,酶的生物催化特性：a、有很强的专一性：底物专一性、反应专一性、立体专一性等；b、有较高的催化效率：比非催化反应高108-1020倍；c、酶的调节功能：抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等,酶的催化效率可用酶活表示。酶活的定义：国际酶学委员会规定，在一定条件下，1 min能催化1 umol底物转化为产物所需要的酶量为一个国际酶活单位（IU)。,2.1.1.3 酶的稳定性,引起酶失活的原因：a、酶活性中心特定氨基酸（或其它）残基 被化学修饰；b、外部环境的影响；c、酶的高级结构变化；d、多肽链的断裂。,2.1.1.3 酶的稳定性,保持酶稳定的方法,2.2 均相酶促反应动力学,什么是均相反应？指酶与反应物系处于同一相（液相）的酶催化反应。,葡萄糖脱氢酶,葡萄糖,葡萄糖酸,水相,酶促反应动力学基础,锁钥模型（Lock and Key Model）,酶与底物的作用机理,解释了酶的专一性；局限性：无法解释可逆反应。,酶与底物的作用机理,诱导契合模型（Induced-Fit Model）,像手与手套的关系。当底物接近酶的活性中心并与之结合时，酶的构象能发生改变，更适合于底物的结合。,影响酶促反应的因素,浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等）外部因素（温度，pH，压力，溶液的介电常数，离子强度等）内部因素（酶的结构等）,反应速率及其测定,若用单位时间内生成物浓度的增加来表示，则：,反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变。,设瞬时dt内反应物浓度的很小的改变为dS，则：,酶促反应动力学分类-反应级数,零级反应 反应速率与底物的浓度无关，称为零级反应。,（S-底物浓度，rmax-最大反应速率）,酶促反应动力学分类-反应级数,一级反应 反应速率与底物浓度的一次方成正比，称为一级反应。即酶催化AB的过程。,（S-底物浓度，k1-一级反应速率常数）,酶促反应动力学分类-反应级数,二级反应 反应速率与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应。,该反应可以是两个相同的反应物反应生成产物（2S P）；也可以是两个不同的反应物反应生成产物（AB P）。,（S-底物浓度；A、B-底物A、B的浓度；k2-二级反应速率常数）,单底物酶促反应动力学,最简单的酶促反应：单底物不可逆酶促反应。,k1,k-1,E,S,ES,E,k2,P,反应机制：,反应动力学方程如何求取？,1.Michaelis-Menten快速平衡学说2.Briggs-Haldane稳态学说,反应动力学方程的推导,快速平衡法的几点假设条件：底物浓度S远大于酶的浓度E，因此ES的形成不会降低底物浓度S，底物浓度以初始浓度计算。不考虑P+EES这个可逆反应的存在。ES在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。,快速平衡学说,E,S,ES,E,快速平衡学说,由假设2可得到产物的合成速率为：,(2),(1),P,由假设3可得到：,反应体系中酶量守恒：,(3),由前面的公式(2)得：,代入公式(3),变换后得：,(4),(5),代入公式(1),变换后得：,式中：,rp,max=k2E0:最大反应速率 如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。KS=k-1/k1:解离常数，饱和常数 低KS值意味着酶与底物结合力越强。,(6),稳态学说,稳态学说的几点假设条件：底物浓度S远大于酶的浓度E，因此ES的形成不会降低底物浓度S，底物浓度以初始浓度计算。在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+EES这个可逆反应的速率极小，可以忽略不计。ES的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。,Experimental data demonstrated the concentration profiles.,当反应系统中 ES的生成速率与分解速率相等时，ES浓度保持不变的状态称为稳态。,由于SE0，所以SES,S-ESS,根据稳态假说，,(7),(3),(8),(Km米氏常数),(9),(10),式中：,对米氏方程的讨论：当SKm时，属零级反应。当SKm时，。,米氏常数Km的意义,Km值代表反应速率达到rpmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH和离子强度等因素会影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。,动力学参数的求解,对rmax和Km的确定的方法有：Lineweaver-Burk法；Hanes-Woolf法；Eadie-Hofstee法；积分法 等。,Linewever-Burk双倒数法,将米氏方程式两侧取双倒数，得到下列方程式：以作图,得到一直线缺点：实验点过分集中在直线的左下方，影响Km和Vmax的准确测定。,例：在pH5.1、15下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度V0如表所示。求这一酶促反应的动力学参数rmax和Km。表1-1 葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度与底物浓度,解：采用Lineweaver-Burk法，对实验数据回归，有则,2.2.2.2 操作参数对酶促反应的影响,pH改变可破坏酶的空间构象，引起酶活的丧失。pH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程受到影响。pH的改变影响活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合或者结合后不能生成产物。,pH对酶反应速度的影响,2.2.2.2 操作参数对酶促反应的影响,温度对酶反应速度的影响,A、在一定范围内，当温度升高时，与一般的化学反应一样，反应速度加快。B、当温度过高，会导致酶的变性，从而失去活性。,抑制剂对酶促反应速率的影响,失活与抑制【失活】(inactivation)：由于酶蛋白分子变性而引起的酶活力丧失的现象称为失活。【抑制】(inhibition)：由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失，称为抑制作用。,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,可逆抑制,【可逆抑制】(reversible inhibition)：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复性，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。【不可逆抑制】：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如：重金属离子对酶的抑制作用。,不可逆抑制,抑制,可逆抑制和不可逆抑制,竞争性抑制(competitive inhibitions),当反应物系中存在与底物的结构相似的物质，这一物质也可能与酶的活性部位结合，形成非活性的复合物，阻碍了酶与底物的结合，从而影响酶促反应，这种抑制作用称为竞争性抑制。,1、抑制剂是底物的类似物；2、提高底物浓度可消除竞争性抑制。,竞争性抑制(competitive inhibitions),非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions),当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑制。,与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，无论如何提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。,非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions),反竞争性抑制(Uncompetitive Inhibitions),这种抑制剂仅能与ES复合物结合，而与游离酶不能直接结合。,各种抑制的比较,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,底物抑制(Substrate Inhibitions),+,X,P,底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。,应用稳态理论，可得到底物抑制的酶促反应动力学方程为,产物抑制(product inhibitions),产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的结合，从而降低了酶促反应的速度。,多底物酶促反应动力学,前面讨论的都是指单底物的酶催化反应，而实际酶催化反应更复杂，可用下列通式表示：,A+B+C+=P+Q+R+,这里仅讨论双底物的酶促反应，根据反应过程中形成的中间复合物的不同，可分为：顺序反应机制;乒乓反应机制。,顺序反应机制,顺序反应是指所有底物与酶结合之后再释放产物。,有序顺序反应,随机顺序反应,顺序反应,有序顺序反应,随机顺序反应,乒乓反应机制,乒乓反应是酶先与一种底物结合后即释放一种产物，酶发生了必要的变构，然后再结合另一种底物，再释放一种产物，释放产物之后酶一般恢复为最初状态。,各种抑制的比较,Km,抑制,抑制,竞争性,反竞争性,非竞争性,Vmax,抑制,变大,不变,不变,变小,变小,变小,2.3 固定化酶促反应动力学,2.3.1 固定化酶促反应动力学基础,2个W和1个H?,What?什么是固定化酶？,固定化酶：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。,酶的固定化技术：是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体，如角叉菜胶、离子交换树脂等材料，制成固相酶的技术。,2.3.1 固定化酶促反应动力学基础,2个W和1个H?,Why?为什么要固定化？,生物工业用酶大多为水溶性，酶促反应体系为均相体系，均相体系简单，但存在一个缺点，就是酶难以回收利用，同时，酶和产物混在一起，给产物的提取带来困难。解决此问题可采用酶的固定化技术。,2.3.1 固定化酶促反应动力学基础,2个W和1个H?,HOW?如何进行固定化？,载体结合法 交联法 包埋法,1.载体结合法制备固定化酶,定义：将酶利用共价键或离子键、物理吸附等方法结合于不溶性载体上的固定化方法。,按载体结合形式分为：共价键结合法 离子键结合法 物理吸附法,载体结合法共价键结合法,酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。,优缺点：,优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长 时间使用。缺点：制备条件复杂，酶蛋白活性中心易破坏。,酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶。,常用载体：纤维素的衍生物，离子交换树脂。,载体结合法离子键结合法,优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶。,缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落。,优缺点：,优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构；方法简单，成本低。缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附的酶蛋白质与载体发生变性反应。,载体结合法物理吸附法,通过物理吸附或静电引力将酶吸附在活性炭、氧化铝、离子交换树脂等具有活泼表面的载体上。,常用载体：无机物：活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶。有机物高分子化合物：淀粉麸质、大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶。,优缺点：,定义：将酶包埋在凝胶的微细格子中或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子不能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过凝胶网络的固定化方法。,包埋方法有两种：,格子型微胶囊型,2.包埋法制备固定化酶,原理：以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。,包埋法格子型固定化酶,原理：把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。,包埋法微型胶囊法,特点：,微囊直径几微米几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内。,包埋法微型胶囊法,定义：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶的方法。,发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巯基 N末端的a氨基,常用的双功能或多功能试剂：戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺,3.交联法制备固定化酶,固定化酶的制法及其特性比较,特性,制备方法,共价键结合法,离子结合法,物理吸附法,包埋法,制备方法,难,易,易,难,酶活力,高,高,高,低,底物特异性,易变,不变,不变,不变,结合能力,强,中,弱,弱,再生,不可,可能,可能,不可,交联法,难,中,易变,强,不可,酶固定化后的性质变化,底物专一性的改变 稳定性增强 热稳定性、保存和使用稳定性。最适pH值和最适温度变化 酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位受影响。动力学参数的变化,固定化酶有利于实现酶促反应的连续化和自动控制。,固定化酶反应历程,微胶囊包埋法固定化酶为例,底物传递至载体外表面；底物由外表面向内扩散；酶促反应；产物由内向外表面扩散；产物传递到流体主体。,固定化酶的催化反应受两方面影响：物质传递和酶促反应。,影响固定化酶促反应的主要因素,分子构象的改变（常见于吸附法和共价偶联法）位阻效应 微扰效应 分配效应（可用Kp 定量描述）,分配系数：载体内外底物(或其他物质)浓度之比。Kp=Csi/Cso Kp的测定：已知底物浓度(CS)，体积(V0)的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cso)。,分配系数(Kp),Csi:微环境的底物浓度；Cso:界面外的底物浓度。,影响固定化酶促反应的主要因素,分子构象的改变（常见于吸附法和共价偶联法）位阻效应 微扰效应 分配效应（可用Kp 定量描述）扩散限制（可定量描述）,水溶酶,本征动力学参数,本征速率和动力学参数,固定化酶,构象改变、位阻效应等,分配效应,固有速率和动力学参数,扩散限制,表观速率和动力学参数,本征速率：考虑到固定化后酶分子的结构改变，底物作用及位阻效应等诸因素后，固定化酶的反应速率称为本征速率。固有速率：假定底物和产物在酶的微环境及宏观环境之间的传递是无限迅速，也就是在没有扩散阻力情况下的反应速率。,不同反应速率与参数及其相互关系,2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析,2.3.2.1 外部扩散过程 以表面固定化酶为例,底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率:式中 V d底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率，（mol/L s）;kL液膜传质系数；a 传质比表面积；S液相主体的底物浓度,(mol/L)；SS固定化酶表面处底物浓度,(mol/L)。,在载体外表面的酶促反应符合M-M方程：式中 VS 载体外表面的底物消耗速率，(mol/L s);SS载体外表面的底物浓度(mol/L)。,在稳定的状态下有:当外扩散速率很快时，此时无外扩散的限制:,VS0为在外扩散速率很快时的最大的反应速率。,当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，此时:,Vd为在外扩散速率很慢时的最大的传质速率。,当S 较低时，VS0 Vd为外扩散限制，此时 当S较高时，VS0Vd为反应限制，此时,令：,无因次形式：,达姆科勒准数(Da),Da准数是C*的函数，其物理意义是最大反应速率与最大传质速率之比。,外扩散效率因子(out),out：表示固体催化剂颗粒催化反应进行的有效程度。,Da准数是决定效率因子的唯一参数，是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。,当Da准数愈小，固定化酶表面浓度Ss愈接近于主体浓度S，out越接近于1，表明最大传质速率愈大于最大反应速率，过程为反应控制；反之，Da准数愈大，固定化酶表面浓度Ss愈小，愈趋近零，out越小，表明最大反应速率愈大于最大传质速率，过程为传质控制。,讨论：,1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积a，但由于粒径减小会伴随压强增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大kL。3、适当提高液相主体的底物浓度，可提高传质速率，降低外扩散的限制。,降低外扩散效应的技术措施,2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析,2.3.2.1 内部扩散过程,固定化载体内的底物浓度的分布特点：,酶、细胞的反应速度与底物浓度是密切相关的,载体内的底物浓度存在着分布不均的问题,沿着传质的方向有底物、产物的浓度的分布,反应速率因底物浓度的分布而在变化,由于底物在载体内的扩散作用以及酶、细胞的反应,2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析,2.3.2.1 内部扩散过程,内扩散效率因子(in),2.4 酶的失活动力学,未反应时酶的失活动力学,一步失活模型 式中:E具有活性的酶，D失活的酶。kd失活反应速率常数。,建立酶失活动力学方程：,边界条件：积分，得,未反应时酶的失活动力学,几个概念：,：一步失活常数：半衰期，当：时间常数，三者关系：,未反应时酶的失活动力学,反应中酶的失活动力学,反应中酶的稳定性与酶的使用寿命直接相关。,酶在反应中的稳定性称为操作稳定性（operation stability）。其测定方法有以下3种：,分批测定法；连续测定法；利用圆二色性分析方法直接跟踪失活酶的结构变化。,本章小结：,酶促反应动力学的生物学基础：酶的基本概念、催化特性等；均相酶促反应动力学：酶与底物的作用方式、影响酶促反应的因素、单底物酶促反应动力学方程的推导。固定化酶促反应动力学：固定化酶的优点、固定化方法、外扩散、内扩散。酶的失活动力学：一步失活模型、半衰期等概念。,复习题：,影响酶促反应的主要因素有哪些？分别利用快速平衡法和稳态法推导竞争性抑制动力学方程。酶的固定化方法有哪些，各自的优缺点分别是什么？书本P51,第16题。,谢 谢！,