球蛋白的分离纯化与鉴定.ppt
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,实验十一,扬州大学医学院生化教研室 傅 奕,Company Logo,Contents,实验目的与要求,实验原理,操作步骤,结果分析,1,2,3,4,Company Logo,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,一、实验目的与要求了解分离纯化蛋白质的基本原理；掌握柱层析技术。,Company Logo,二、实验原理,本实验为一综合性大实验，目的是要从血清中获得纯化的-球蛋白。,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,血清中的蛋白质有两大类：清蛋白和球蛋白（、）。,（一）如何分离得到球蛋白？,盐析：,清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而绝大部分清蛋白保持溶解状态，依此可将球蛋白和清蛋白分离(离心）。,得到球蛋白,Company Logo,二、实验原理,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（二）如何去除球蛋白中的无机盐（硫酸铵）？,凝胶层析（凝胶过滤）,脱盐,凝胶层析又称凝胶过滤，是选用孔隙大小一定的凝胶，将混合液中的小分子和大分子物质“筛”开来的一种分离方法。,葡聚糖 G-25,纯化的球蛋白,Company Logo,二、实验原理,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（三）如何分离得到纯化的-球蛋白？,在乙酸铵溶液（pH6.5）中,、-球蛋白带负电荷,而-球蛋白带正电荷,Company Logo,二、实验原理,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（三）如何分离得到纯化的-球蛋白？,如何将带有不同性质电荷的蛋白质分离呢？,离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。,离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆 的交换过程；带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带 负电荷的交换剂称阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，其分子带电 形式为：纤维素-OC2H4N+H(C2H5)2，溶液中带负电荷的离子可 与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达 到分离纯化的目的。,Company Logo,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,+,Company Logo,二、实验原理,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（三）如何分离得到纯化的-球蛋白？,因、球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合。而-球蛋白带正电荷而不与DEAE纤维素进行交换结合，直接从层析柱流出。故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分 蛋白质即为纯化的-球蛋白。,纯化前后的-球蛋白可用电泳法进行比较鉴定。,（四）如何鉴定-球蛋白及纯度？,Company Logo,二、实验原理,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,1.盐析：分离球蛋白与清蛋白。,2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐（脱盐）。,3.离子交换层析：将-球蛋白与、-球蛋白分离。,4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度。,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,1.盐析：分离球蛋白与清蛋白,取血清0.75 ml，缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液 0.75 ml，边加边摇，混匀后于室温中放置10分钟，然后10000rpm离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4 ml，使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐（脱盐）,（1）装柱：,（a）固定层析柱，保持垂直。（b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。（c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打 开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 许溶液。关闭出口。避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉 降，使表层平整。,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面,使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面,用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上,然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口,小心加入少量乙酸铵（约1ml）洗层析柱内壁上的样品，打开出口，使溶液进入凝胶,加入适量乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集15滴,淡黄色,仔细清洗试管,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（3）洗脱液中蛋白质的检测：按洗脱液的管号顺序分别取1滴液体，滴于玻片上，滴加 20磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。合并蛋白含量高的各管，此即已脱盐的球蛋白溶液，除留少量作电泳鉴定用外，其余用于DEAE-纤维素阴离子 交换柱。,最多合并三管即可,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,3.离子交换层析：将-球蛋白与、-球蛋白分离。,（1）装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测,装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有 关注意事项同前述。,上样前DEAE-纤维素柱的平衡：装柱后用0.02 M乙酸铵（pH6.5）冲洗2遍。,将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE-纤维素阴离子交换柱 上，用乙酸铵洗脱，样品进入柱床后立即开始收集洗脱液，检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。,留少量做电泳,此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,（2）浓缩将纯化的-球蛋白溶液量体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25干胶0.25g，摇动2-3分钟，离心5分钟（10000r/min），上清即为浓缩的-球蛋白溶液，留待电泳鉴定。,Company Logo,三、操作步骤,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度（比较纯化前后的蛋白质）,每组取醋酸纤维素薄膜3张，按如下操作：样品：(1)血清；(2)凝胶层析脱盐后的球蛋白溶液；(3)DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化后的-球蛋白液 电泳及染色：方法同醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验。（点样面朝下、点样端靠近负极，氨基黑10B染色）,不可重复点样,须重复点样,须重复点样，约15次左右,Company Logo,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,葡聚糖G-25 和DEAE纤维素：实验结束后，用乙酸铵冲洗3遍后，回收至原烧杯。,注意：,Company Logo,四、结果分析,血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定,比较电泳结果，然后作出分析。,Company Logo,Thank You!,
