现代分子生物学蛋白质.ppt

,蛋白质互作Protein-protein interaction,1.蛋白质互作研究的意义2.蛋白质互作（事例）3.细胞内蛋白质标记4.其他进展,References：Bruce Alberts et al,Molecular Biology of the Cell(5th edition),Garland Science Erica Golemis et al,Protein-protein InteractionA Molecular Cloning Manual papers,1.蛋白质互作研究的意义(Importance),生命活动 细胞活动:基因是关键,基因表达调控,与其它分子结合:信号转导,转录,蛋白质:修饰,翻译,蛋白作用,单个蛋白:较少,蛋白复合体,动态,蛋白质相互作用:结构,最具挑战性,分子水平：基因组DNA：基因重排，Ig多样性 基因序列多样性（Science.2004，305:251-254），抵抗 不同病原（低等动物）等作用 DNA修饰，甲基化（epigenomics），S修饰等mRNA：启动子，ChIP，EMSA 非编码小RNA（siRNA，miRNA，piRNA）（epigenomics）蛋白质：蛋白质互作（蛋白质组学）蛋白质结构（工具，生物信息学）蛋白质标记（细胞固定，活细胞标记）异构体,2.蛋白质互作（protein-protein interaction）事例,病毒-对虾蛋白互作 经济模式动物,White spot syndrome virus(WSSV),对虾:无脊椎动物，仅有先天性免疫系统,无特异性免疫,体表阻挡,细胞系统：吞噬细胞、细胞凋亡,体液防御系统：干扰素、抗病毒肽、凝集素等,无脊椎动物免疫系统,1)概述开始研究前，必须了解研究背景,（1）模式识别：模式识别因子（2）信号转导：受体藕联蛋白 信号转导（3）抗病毒效应：干扰素,抗病 毒肽,细胞凋亡,细胞吞噬。,蛋白质互作,非特异性免疫,特异性免疫,Nature 2005,434:27,蛋白质互作,如何开始研究?,抗病对虾：mRNA差异显示技术（DD-PCR），抑制差减杂交，亲和层析,70个对虾抗病相关基因，其中30个新基因,2)对虾抗病毒相关功能基因筛选,Rab6:抗病毒对虾中上调表达 说明在抗病毒免疫反应中起作用 重要的小G蛋白,小G蛋白:GTPase,20-25 kDa,5个家族Ras:细胞生长调节Rho:actin细胞骨架重组,基因表达调控Rab:膜性颗粒的锚定与融合Arf:调节膜性颗粒的运输Ran:调控核内运输,胞质,细胞核,Rab蛋白在体内以两种构象形式存在，活化的Rab蛋白为GTP结合形式，位于 胞膜；未活化的Rab蛋白与GDP结合，位于胞浆。,Cell,2007,129:865,Thierry Galvez et al.2012.Cell 151:234,Rab蛋白:所有的真核生物中都有Rab蛋白 酵母中的Rab蛋白称为Ypt蛋白,7个Rab蛋白 线虫(C elegans)29种Rab蛋白 果蝇(Drosophila melanogaster)26种Rab蛋白 拟南芥(Arabidopsis thaliana)57种Rab蛋白 人有60多种Rab蛋白,PM1-3，G1-3:与GTP结合/分解相关的保守区,G结构域F1-5:Rab的保守区高度可变的N端和C端,G结构域:6个折叠(1-6),5个螺旋(1-5)和5个多肽环。多肽环:折叠与螺旋之间由多肽环连接 氨基酸序列高度保守 Mg2+和鸟嘌呤的结合位点，同时催化 GTP水解 开关I和开关II:Rab蛋白与它的GEF和GAP的关 键位点,Rab6在抗病毒对虾中上调表达,参与抗病毒免疫反应,参与免疫的途径?,筛选与Rab6结合的蛋白质,蛋白互作,GST pull-down,CoIP,酵母(细菌)双杂交,噬菌体展示,蛋白质芯片,Native/SDS-PAGE,蛋白质鉴定,蛋白互作验证,功能,3)互作蛋白筛选,His tag,SDS-PAGEWestern blot,Co-Immunoprecipitation(CoIP),不受互作蛋白结合位点影响蛋白条带较多,Yeast 2-Hybrid Assay,细菌双杂交,文库筛选，检测2个蛋白互作,噬菌体展示,蛋白质芯片,4)互作蛋白的鉴定,N端测序:Edman sequncing 需要大量纯化的蛋白质 N末端封闭质谱(masspectrometry,MS)分析 常用,基因组序列,MALDI-TOF MS:matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flightESI-MS/MS:nano-electrospray ionization tandem MS(Q-TOF)MALDI-Q-TOF,TOF/TOF,生物样品离子化方法,5)蛋白互作的验证,体外:Western blot体内:细胞试验,酵母(细菌)双杂交,6)功能体内,RNAi抑制Rab6基因的表达对血细胞吞噬功能的影响,Rab6基因过量表达对血细胞吞噬功能的影响,Rab6基因沉默对病毒感染的影响,VP466,Rab,tropomyosin,actin,900-1020 bp,互作片段,信号通路 VP466-tropomyosin-actin,VP466：感染必需蛋白,信号通路VP466-Rab6-actin,Rab6 N端：与VP466互作必需,体外,体内,VP466为Rab6的GAP,信号通路VP466-Rab6-actin,VP466激活Rab6，Rab6影响actin构象，促进吞噬,信号通路VP466-Rab6-actin,果蝇：Rab6-actin,果蝇：Rab6-actin,VP466,Ran,myosin,actin,细胞吞噬,细胞吞噬 Ran,tropomyosin,Rab,RNAi,overexpression,N,P,小分子siRNA,小G蛋白（Rab，Ran）与骨架 蛋白直接作用调控吞噬病毒双功能蛋白,蛋白质复合体标记,病毒感染 Rhodamine-Phalloidin,3.细胞内蛋白质标记（protein labeling in vivo）,蛋白质互作：生化数据，体外分析细胞、个体观察：蛋白质标记,荧光标记(fluorecence labeling)常用：小分子有机染料与各种抗体相连接或特异的荧光标记物，研究 各种目的蛋白 需要对细胞进行固定等操作 进展：直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧 光标记物 荧光蛋白：非侵入性的活体细胞成像 荧光蛋白-目的蛋白融合表达：过量表达 目的基因失活突变体（株）,1）荧光标记物2）标记蛋白技术 3）应用,1）荧光标记物,小分子有机染料分子量小于1KD与生物大分子共价连接对其进行标记染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性利用：扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类 吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。有数百种荧光染料商品，如DAPI，FITC，Rhodamine，Hoechst，PI，DTAF，phalloidin等多与抗体联用,荧光蛋白 最早：藻胆蛋白（phycobiliproteins），蓝藻中提取的触角光合色素 含有多种胆汁三烯生色基团，生色基团包裹在一种基质结构中，将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度 要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。蛋白分子量200KD，限制了它们在细胞内的扩散，只能与抗体联 用，在流式细胞或ELISA中用来检测细胞表面的蛋白质分子 后来：维多利亚发光水母（Aequorea victoria）中发现GFP，生物成像 发生革命性改变，单独表达GFP或与其它蛋白融合表达,GFP,依赖钙离子,荧光蛋白（GFP，RFP，YFP，CFP）大都来自海洋腔肠动物 荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但 酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光,量子点（Quantum Dot）（2000）无机纳米结晶体，冷光半导体纳米颗粒可根据其大小发出特定波长的荧光，具有非常高的消光系数（比小分子 荧光基团和荧光蛋白高出10-100倍），量子产率也非常好典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面 包裹一硫化锌（ZnS）外壳吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，一束 单波长激发光就可以让量子点达到多重发射量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）等分子相连，但结合生物大分子的量子点体积过大（直径约10-30nm），阻碍它通 过细胞膜结构，只能用于经透化处理的细胞或只能对胞外蛋白和可 被细胞内吞的蛋白进行研究量子点的光稳定性使其能够反复成像，其大小和电子密度特性又使得它适 合用于电镜研究在亲水的树枝状高分子聚合物中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，也具有波长可调性，这种新型材料可望在细胞生物学领域应用,应用限制：与生物大分子连接，体积大,量子点结构模式图,量子点与抗体及生物素连接模式图,Color Qtracker 细胞标记效果3T3细胞(绿色),HeLa细胞(红色),U188细胞(白色)分别用 Qtracker 565,655,和705 进行了荧光标记,纳米颗粒Bruce E.Cohen.2010.Nature 467:407-408有机纳米颗粒：钛酸钡（BaTiO3）可代替无机荧光染料 用于活组织的成像荧光染料成像原理：荧光分子吸收光，发出比吸收光能量低的荧光 吸收光与散射光的能量差异称为Stokes shift，保证发出荧光荧光染料的缺点：1）细胞本身有许多荧光分子，产生荧光背景 2）荧光显微镜的激发光可能损伤细胞，如紫外光 等；光损伤可能间接发生，荧光分子与其它分 子发生反应解决荧光染料的缺点：构建双光子显微镜（two-photon microscope）采用脉冲近红外线激光，发出比激发光能量高 的光该文：采用第二次谐波产生技术 发现barium titanate(BaTiO3)晶体（纳米颗粒），30 nm 比核糖体的直径大2倍 有望代替荧光染料的材料：量子点和纳米颗粒,活细胞染色染料Invitrogen product listC10106 Cellular Lights Tubulin-GFP*BacMam 1.0*C10112 Cellular Lights Tubulin-RFP*BacMam 1.0*C10126 Cellular Lights Actin-GFP*BacMam 1.0*C10127 Cellular Lights Actin-RFP*BacMam 1.0*O10100 Organelle Lights Lysosomes-RFP*BacMam 1.0*O10104 Organelle Lights Endosomes-GFP*BacMam 1.0*O36210 Organelle Lights Mito-GFP*BacMam 1.0*O36231 Organelle Lights Endosomes-RFP*BacMam 1.0*P36232 Premo FUCCI Cell Cycle Sensor*BacMam 1.0*P36235 Premo Autophagy Sensor LC3B-GFP*BacMam 2.0*P36236 Premo Autophagy Sensor LC3B-RFP*BacMam 2.0*,2）标记蛋白技术,免疫标记法检测内源性蛋白最常用方法用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆 蛋白或量子点的二抗显色；或者，直接将荧光标记物或生物素连接 在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。如果没有高质量的抗体，可将荧光标记物与靶蛋白融合过量表达缺点：该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可被细胞内吞的 蛋白；抗体标记物的多价性可能会导致靶蛋白形成寡聚体 荧光标记复合体通常分子量会超过200KD，可能影响蛋白互作,+、+/-、-分别表示“应用范围较广”，“在某些领域内有所应用”，“较少应用”,遗传标记法荧光蛋白与靶蛋白融合表达，转染、转基因缺点：表达的蛋白不是内源性蛋白 荧光蛋白分子大小会影响目的蛋白功能 荧光蛋白的限制性改进：靶基因突变株或RNAi 活细胞内或细胞表面将小分子荧光标记物与目的蛋白共价连接或 通过酶进行连接 例：四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical染料系统 12aa肽段（含4Cys），Cys与透过细胞膜的biarsenical染 料结合（高亲和力），形成FlAsH或ReAsH，发出绿色或 红色荧光 同时使用小分子二巯基化合物解毒剂可降低靶蛋白与染料 间亲和力，减少毒性反应 Tetracysteine对目的蛋白的影响比荧光蛋白小得多 可用于亲和纯化、荧光蛋白辅助的光灭活作用、检测蛋白 质合成过程、进行脉冲追踪标记、电镜定位等 biarsenical染料会造成背景荧光偏高，未用于转基因动 物，不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色phalloidin:actin,HaloTag技术 蛋白标记示踪+融合表达+蛋白分离,具体步骤：1.构建带有HaloTag和目标蛋白的融合 表达载体 2.转染目标细胞，可按需要选择瞬时转 染或稳定转染 3.培养细胞至表达产物 4.选择合适的荧光配基或生物素与细胞 共同孵育5-60分钟，配基穿越细胞膜 和HaloTag形成共价结合，然后洗掉未 结合的配基。5.分析研究：活细胞荧光成像；或者固 定细胞成像；细胞裂解以及蛋白亲和 纯化/捕获，或凝胶分析。,3）应用,蛋白质表达、蛋白质定位,流式细胞：蛋白质表达、蛋白质活性 特异结合磷酸化蛋白的被荧光标记的抗体，观察内源蛋白 质的活化状态；荧光标记抗体，检测蛋白表达 同时对17种荧光进行检测,光镜/电镜：蛋白质定位共聚焦显微镜观察荧光基团在光照下产生单线态氧，容易对荧光基团自身起漂白作用，而 且可将局部的二氨基联苯胺氧化形成电镜下的嗜锇小体。量子点可以用于光镜和电镜,A，B 内源性蛋白一抗标记、染料-二抗标记D，E：融合表达荧光蛋白，tetracysteine标记,Different frames from time-lapse microscopy are shown for CID-GFP(Drosophila CENP-A,centromere marker)coexpressed with H2B-mRFP(chromosome counter stain)at 1,64,83 and 138 minutes.Purple indicatescell outlines taken by transmission light.,共定位：质粒共表达,Caroline Grabbe and Ivan Dikic.2008.Science 322:872-873,IRES,蛋白质在细胞内的弥散过程和运输过程,蛋白在细胞内运动、分布、活化、信号通路、第二信使等，可通过成像 技术观察其变化过程单粒子示踪技术（single-particle tracking）：对单个分子、聚合物或细胞器等进行观察；被观测的粒子必须足够亮，彼此间隔足够大,Rab（蓝），actin（红）细胞核（蓝）,Phagocytosis of C.albicans by Drosophila S2 Cells.The Drosophila hemocyte-like S2 cell line phagocytoses C.albicans.S2 cells were co-incubated with GFPexpressing C.albicans for the Indicated times.Cells were fixed,and the filamentous actin of S2 cells was stained with Rhodamine phalloidin and the S2cell DNA with Hoechst 33258.,荧光相关光谱技术（Fluorescence correlation spectroscopy）：针对分子荧光物理参数瞬时细微涨落的探测及其与时间相关处理的技术对荧光标记蛋白进入或离开某一激光焦点区域导致的荧光强度的改变情 况进行统计学分析，以此来分析蛋白质的运动情况。记录的荧光分子的涨落是由于荧光分子扩散进入和逃出一个小的激发体 积形成的，其中激发体积的大小由聚焦激发激光质量所决定。激发 体积内分子发射的荧光强度是通过记录一个个光子获得的。假设激 发光是稳定的，则荧光强度的涨落被定义为信号时间平均值的偏离。探测这些偏离可以获得的化学和物理参数是局部浓度、迁移率系数、结合和分离比例常数，以及酶动力学参数。衍生方法：影像相关光谱学技术，对荧光图像进行测量，发现不同图像 间的变化情况，对细胞内蛋白间互作和蛋白动力学进行 了解,光标记技术（photomarking methods）：各种荧光蛋白都可以被破坏（图F）、被去淬灭或者被光活化作用改变颜 色（图E），经过上述处理的荧光标记分子可直接进行成像研究,E：光活化作用。强烈的光刺激改变局部荧光蛋白的发射光谱，从而发现蛋白运 动情况F：FRAP作用。强烈的光刺激可以让局部的荧光被漂白，但新合成蛋白或从别处 运动过来的蛋白仍然会发出荧光；,光脱色荧光恢复（Fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)：先用荧光物质标记膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射细胞表面某一区域，使被照射区域的荧光淬灭变暗形成一个漂白斑。由于膜的流动性，漂 白斑周围的荧光物质随着膜蛋白或膜脂的流动逐渐将漂白斑覆盖，使 淬灭区域的亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光光强度相等。根 据荧光恢复的速度，可推算分子的扩散速度 FRAP能证明膜的流动性，也能测量膜蛋白扩散的速率。,量子点：因亮度和光稳定性非常高，可反复成像 很难在活体细胞内对量子点标记的胞质蛋白进行观测 免疫靶向的抗生物素蛋白链菌素标记的量子点（immunotargeted streptavidin-QDs）,荧光标记技术在蛋白质构象改变研究中的应用研究蛋白随时空间改变而发生构象改变时，最常用方法是将某一蛋白质结 构域与2个荧光基团结合，然后对该结构的萤光共振能量转移（FRET）进行检测常用荧光基团有CFP、YFP等,FRET 传感器：底物经修饰（橙色，磷酸化修饰）导致构象改变，通过 FRET使发青色荧光的CFP发黄色荧光 FRET效率取决于供体与受体间的距离和方向FRET反映蛋白分子内部因方向而不是距离改变所造成的构象改变，因为荧 光蛋白分子中有一个发生交替排列或者接头长度发生微小的改变都会 给FRET带来很大的影响，这要比2个荧光蛋白分子间的距离改变对FRET 造成的影响大得多连接2个荧光蛋白的蛋白质在生化信号的影响下改变构象如果与定位信号序列融合，这种结构可用于对胞内特定的亚细胞结构研究,荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的 激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。两个发色基团间能量转换效率与它们间的空间距离的6次方成反比，对空 间位置的改变非常灵敏 例 用CFP作供体、YFP作受体，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激 发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团 上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。,FRET技术原理示意图,荧光标记技术在蛋白与蛋白互作中的应用FRET用于活体细胞内研究蛋白间互作（图）,三分子FRET作用：蛋白X和Y结合后，使发青色荧光的CFP发黄色荧光，再与蛋白Z结合发红色荧光 这种方法已用于多蛋白复合体以及三聚体蛋白研究中,BiFC技术可用于研究蛋白表达BiFC技术具有很高的信噪比，因为它可以形成新的荧光；试验花费时间长,BiFC技术：蛋白X与Y结合导致GFP的2个裂解片段结合在一起，形成生色基团，发出绿色荧光,双分子荧光互补技术（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）：,原理：利用荧光蛋白及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成 2个不具有荧光活性的分子片段，分别与目标蛋白连接。若2个目标 蛋白因为互作而靠近，使得荧光蛋白的2个分子片段在空间上相互 靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，直 接观察2目标蛋白是否有互作，且在最接近活细胞生理状态下观察 其互作发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其互作的影响等,荧光标记技术在蛋白质合成和降解过程研究中的应用蛋白质降解：分辨“陈旧的”蛋白和“新生的”蛋白常用方法：用不可逆标记对某一时刻合成的所有蛋白质进行标记，再用另 一种颜色的荧光对迟些时候新生成的蛋白质进行标记 例：1）用高亲和力配体或标记有荧光基团的抗体对内源性蛋白和胞外蛋白 进行标记 2）先用一种双砷（biarsenical）染料标记四半胱氨酸（Tetracysteine）序列，然后用另一种双砷染料进行标记 FLAsH（bis-arsenical fluoroscein derivative）：联砷荧光素衍生物 合成的 细胞可透 FLAsH结合四半胱氨酸:发夹型结合物 FLAsH（绿），ReAsH（红），HoXAsH（蓝），CHoX-As（蓝）等,脉冲追踪技术：Tetracysteine序列标记的蛋白被绿色染料标记后，形成能发出绿 色荧光的FIAsH（绿色小点）；去掉绿色染料后，用红色染料标 记新生的蛋白，形成能发出绿色荧光的ReAsH（红色小点）,HaloTag标记,TNF-dependent degradation of IkB-HaloTag fusion protein.a)Time series of images showing HEK-293 cells transiently expressing the IkB-HaloTag fusion protein labeled with the TMR ligand.Degradation was prevented by treatment of the cells with 10 M lactacystin for 30 min.b)Mean cellular fluorescence intensities were determined at each time pointc)Western blot analysis of IkB-HaloTag fusion protein degradation.Cells were treated with TNF-(10 ng/mL)and harvested at the indicated times.Proteins were resolved by SDS-PAGE and visualized using an anti-IkB antibody.,利用依赖生色基团的光灭活作用来控制蛋白质的活性通过免疫染色对目的蛋白进行标记，荧光基团受光照活化后会生成ROS，尤其是生成单线态氧，利用这种特性将目的蛋白灭活摧毁胞内靶蛋白效率：ReAsH FlAsH荧光素 孔雀绿GFP这种灭活蛋白的方法比基因敲除或RNA干扰好,H：电镜下光氧化作用。对ReAsH（红色小点）进行强烈的光刺激后，形成ROS ROS使DAB发生多聚化反应沉淀下来（棕色），DAB沉淀可被黑色的锇染料 着色，在电镜下被观察到I：CALI作用。对ReAsH（红色小点）进行强烈的光刺激后生成ROS，ROS氧化 并灭活目的蛋白,蛋白质组学中的标记技术细胞培养氨基酸稳定同位素标记（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture，SILAC）丹麦Mann实验室（2002），首次用于定量蛋白质组研究原理：分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基 酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替 代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量 等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。,蛋白质或蛋白复合体实时观测,4.其它进展,Toll-like receptor,Cell membrane receptor,GPCR,TCR,MHC,Interleukin receptor,Draper,TEPs,LRP,Toll样受体,DSCAM,V-ATPase,CD分子,complement receptor,GNBP,CED,scavenger receptors,Peste,Integrin,Fc受体,CL-SF,PGRP,BCR,Nuclear pore complex,Nimrod,MAPK,NF-kB,ARF,MCR,Ig-SF,IgG,IgM,Eater,HIV蛋白互作,蛋白互作是动态的,Science,2008,320:1429-1430induced fit and conformation selection mechanisms:prior to the binding interaction,the unliganded protein exists as an ensemble of conformations in dynamic equilibrium.three steps:a diffusional encounter,recognition of complementary structures contained within the conformational ensembles of the free proteins,and conformational relaxation into the final bound state,Structural biology technology To realize biological macromolecule functions by three-dimensional structure,X-ray crystallographynuclear magnetic resonance(NMR)spectroscopy computer graphicsCryo-electron microscopy(CryoEM),