现代分子生物学第七章真核生物基因表达调控.ppt

真核基因表达调控,第 七 讲,绪论一、真核基因组的一般构造特点二、真核基因的转录三、反式作用因子对转录的影响四、真核基因表达调控的主要模式五、其它水平上的基因调控,本章主要内容,绪论,真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组就包含有3109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA的1000倍，是噬菌体总DNA的10万倍左右！真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。,真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。转录水平调控；转录后水平调控；翻译水平调控；蛋白质加工水平的调控等。,研究基因调控主要应回答的3个问题：,什么是诱发基因转录的信号？基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？不同水平基因调控的分子机制是什么？,一、真核基因组的一般构造特点,1、真核基因组的复杂性真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。,细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题。原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。,原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列：高度重复序列，这类序列一般较短，长10300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的1060%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。中度重复序列，这类序列多数长100500bp，重复101105次，占基因组10-40%。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次。单拷贝序列，这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。,2、真核基因组的一般构造特点,在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。,在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑RNA聚合酶与它的结合。真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质,3、真核基因表达调控的特点,(1)真核基因表达调控的环节更多真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排，即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。,此外，真核细胞中还会发生基因扩增，即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如MTX是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的DNA区段扩增4000倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。,(2)真核基因的转录与染色质的结构变化相关,1.染色质结构影响基因转录：松散的常染色质中的基因可以转录。紧凑折叠结构的异染色质从未见有基因转录表达，可见紧密的染色质结构阻止基因表达。2.组蛋白的作用：组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用。3.转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加：高敏感点常出现在转录基因的5侧区、3末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近，分析该区域核小体的结构发生变化，可能有利于调控蛋白结合而促进转录。,4.DNA拓扑结构变化：天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。5.DNA碱基修饰变化：真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5甲基胞嘧啶，这种甲基化最常发生在某些基因5侧区的CpG序列中，这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，可见DNA的甲基化对基因表达调控是重要的。,(3)真核基因表达以正性调控为主,真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍；真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正性调控为主导。,4、真核生物基因家族,简单多基因家族 rRNA基因家族原核生物中16S、23S、5S的rRNA基因联合为一个转录单位，细菌所有rRNA和部分tRNA都来自30S的前体rRNA真核生物中18S、28S、5.8S的rRNA包括在45S的前体rRNA分子中，经甲基化后被特异的RNA切割酶切割而成。,复杂多基因家族,复杂多基因家族由几个基因家族构成，其间由间隔序列隔开。组蛋白基因家族5个基因组成串联单位且重复1000多次串联单位中每个基因分别转录成单顺反子RNA，这些的RNA都无内含子，在一条DNA一按同一方向转录。,发育控制的复杂多基因家族,珠蛋白基因家族人类发育阶段中血红蛋白组成的变化：所有动物血红蛋白基因的基本结构相同，但在个体发育不同时期却出现不同形式的亚基。,5、真核基因的断裂结构（外显子与内含子）,外显子：编码序列（10%左右？）内含子：非编码序列只有真核生物具有切除基因中内含子，产生功能型mRNA和蛋白质的能力。外显子与内含子连接区：外显子与内含子的交界或边界序列，特征：内含子两端序列不能互补，其上游和下游序列不能形成发卡结构，连接区序列很短，但却高度保守，可能是RNA剪切的信号序列。外显子与内含子的可变调控：组成性剪接：基因转录产物精确剪接成一种mRNA选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同的mRNA,6、真核生物DNA水平上的基因表达调控,1、开放型活性染色质结构对转录的影响转录前染色质在特定区域发生核小体结构的消除或改变、DNA本身局部结构变化、DNA从右旋到左旋转变等，促使结构基因暴露而诱发基因转录.处于活跃状态的基因的在染色质上有一个或数个DNA酶I敏感位点（多位于5端启动区）比非活跃态基因易被DNA酶I所降解。DNA酶I敏感位点的产生是染色质结构规律变化的结果，该变化使DNA易与RNA聚合酶和其它转录调控因子结合，从而启动基因表达，也易被DNA酶I所降解。,2、基因扩增卵母细细胞形成发育过程中，基因（如rDNA）大量扩增以满足大量蛋白质的需要。例：非洲爪蟾及果蝇卵母细细胞发育3、基因重排与变换将一个基因从远离启动子处移到距它很近的位点从而启动转录。例：免疫球蛋白结构基因和T细胞受体基因的表达,在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(和链)基因座都由多个编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA（连接区，J区）所分隔。V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排，大量间隔序列被切除，使位于J-C之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。酵母细胞的“交配型转换”（基因转换）（P249图）,7、DNA甲基化与基因表达,DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化的主要形式 5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中。原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。,真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型甲基转移酶，另一种是 从头合成型甲基转移酶。前者主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。后者催化未甲基化的CpG成为m CpG，速度很慢。日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。,由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以，高等真核生物中CG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CG 序列，大多位于转录单元的5区。没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就可能被氧化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用,它就变为T,无法被区分。因此,CpG序列极易丢失。,返回首页,DNA甲基化抑制基因转录的机理：DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性，从而影响到DNA与蛋白质相互作用方式的改变，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。主要是不利于模板DNA与RNA聚合酶的结合。如：引起BDNA向ZDNA过渡启动区DNA上的DNA甲基化密度与基因转录受抑制程度相关，其影响与MeCP1结合DNA的能力成正相关。甲基化CpG的密度和启动子强度间的平衡决定该启动子是否有转录活性。（P252图）,二、真核基因的转录（顺式作用元件）,真核生物转录调控是通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现的。此节主要介绍顺式作用元件。真核细胞的三种RNA聚合酶(、和)中，只有RNA聚合酶能转录生成mRNA真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括：启动子增强子近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子,1、真核基因的启动子,启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。不同的启动子对RNA聚合酶的亲和力不同，所结合的反式作用因子也不同，因此，基因转录活性也很不相同。,人金属硫蛋白基因的调控区说明真核基因上游启动子元件的组织情况和各元件相应结合的转录因子,典型的原核启动子有四大要素 转录起始位点，-10区，-35区和-10区与-35区之间的间隔。原核基因转录起始位点：通常是嘌呤，其序列为CAT-10区：是一个6碱基保守序列（常以-10为中心）。T80A95t45A60A50T96，有助于DNA的解链。-35区：是另一个6碱基保守序列（常以-35为中心）。T82T84G78A65C54a45,真核基因启动子：启动子中的元件可以分为两种：核心启动子元件：指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游25/30bp处的TATA盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。上游启动子元件：包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的调控。以人金属硫蛋白基因为例，说明真核基因上游启动子元件的组织情况和各元件相应结合的转录因子。,真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子：由RNA聚合酶I负责转录的rRNA基因，启动子（I类）比较单一，由转录起始位点附近的两部分序列构成。第一部分是核心启动子，由-45+20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。另一部分由-170-107位序列组成，称为上游调控元件，能有效地增强转录效率。,2、RNA聚合酶,由RNA聚合酶负责转录的是5SrRNA、tRNA和某些核内小分子RNA（snRNA），其启动子（类）组成较复杂，又可被分为三个亚类。两类5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子，位于转录起始位点的下游，都由两部分组成。第三类启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游。由RNA聚合酶II负责转录的II类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snRNA基因，后者的启动子结构与III类基因启动子中的第三种类型相似，编码蛋白质的II类基因启动子在结构上有共同的保守序列。转录起始位点没有广泛的序列同源性，但第一个碱基为腺嘌呤，而两侧是嘧啶碱基。这个区域被称为起始子，序列可表示为Py2CAPy5。Inr元件位于-3+5。仅由Inr元件组成的启动子是具有可被RNA聚合酶II识别的最简单启动子形式。,也有一些II类启动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。,多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定。TATA盒存在于所有真核生物中，TATA盒是一个保守的七碱基对，其序列为：,原核基因启动区范围较小，而真核基因启动区范围较大。TATA区主要作用是使转录精确地起始。CAAT区和GC区主要控制转录起始频率。不是每个基因的启动子区都包含三种序列，真核细胞中存在大量特异性或组成性表达的、能与不同基因启动子区结合的转录调控因子。,3、增强子及其对转录的影响,是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒DNA中转录启始位点上游约200bp发现有两段72bp长的重复序列，可使旁侧的基因转录提高100倍。其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。,作为基因表达的重要调节元件，增强子常具有下列性质：,1、增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。经人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍!2、增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距3 kp，或在基因下游，均表现出增强效应；3、大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的；,4、增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5、没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；6、许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,增强子的作用原理是什么呢？一种观点认为，增强子为转录因子提供进入启动子区的位点。第二种认为，增强子能改变染色质的构象。因为增强子区域容易发生从B-DNA到Z-DNA的构象变化。,增强子的功能是可以累加的。SV40增强子序列可以被分为两半，每一半序列本身作为增强子功能很弱，但合在一起，即使其中间插入一些别的序列，仍然是一个有效的增强子。因此，要使一个增强子失活必须在多个位点上造成突变。对SV40增强子而言，没有任何单个的突变可以使其活力降低10倍。,4.沉寂子,最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看到：沉寂子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。,返回首页,三、反式作用因子对转录的影响,1、反式作用因子以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(TF)。RNA聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。在真核细胞中RNA聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。与RNA聚合酶、相应的转录因子分别称为TF、TF、TF，对TF研究最多。下表列出真核基因转录需要基本的TF。,RNA聚合酶的基本转录因子转录因子分子量（kD)功 能TBP30与TATA盒结合TF-B 33介导RNA聚合酶的结合TF-F 30,74 解旋酶TF-E 34,37 ATP酶TF-H 62,89 解旋酶TF-A12,19,35 稳定TF-D的结合TF-I 120 促进TF-D的结合,一般认为，如果某个蛋白是体外转录系统中起始RNA合成所必需的，它就是转录复合体的一部分。根据各个蛋白质成分在转录中的作用，能将整个复合体分为3部分：参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。与转录的起始或终止有关的辅助因子，也不具有基因特异性。与特异调控序列结合的转录因子。它们中有些被认为是转录复合体的一部分，因为所有或大部分基因的启动子区含有这一特异序列，如TATA区和TFIID，更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白，它们是起始某个（类）基因转录所必需的。,研究最多的是与TATA盒结合的蛋白因子TFD，后来发现TFD实际包括两类成分：与TATA盒结合的蛋白是TBP，是唯一能识别TATA盒并与其结合的转录因子，是三种RNA聚合酶转录时都需要的；其他称为TBP相关因子(TAF)，至少包括8种能与TBP紧密结合的因子。转录前先是TFD与TATA盒结合；继而TFB以其C端与TBPDNA复合体结合，其N端则能与RNA聚合酶亲和结合，接着由两个亚基组成的TFF加入装配，TFF能与RNA聚合酶形成复合体，还具有依赖于ATP供给能量的DNA解旋酶活性，能解开前方的DNA双螺旋，在转录链延伸中起作用。这样，启动子序列就与TFD、B、F及RNA聚合酶结合形成一个“最低限度”能有转录功能基础的转录前起始复合物(PIC)，能转录mRNA。,RNA聚合酶转录复合体的形成示意图,转录前先是TFD与TATA盒结合TFA结合在TFD上游TFB结合在转录起始位点附近RNA聚合酶与TFF偶联形成复合体结合到转录起始位点TFE结合在RNA聚合酶的下游TFH和TFJ结合上去，形成完整的转录起始复合物,不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的转录因子结合，这些转录因子通过与基础的转录复合体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同的转录因子，看到的现象是：同一DNA序列可被不同的蛋白因子所识别；能直接结合DNA序列的蛋白因子是少数，但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转录因子是通过蛋白质蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的(见图)。转录因子之间或转录因子与DNA的结合都会引起构象的变化，从而影响转录的效率。,转录因子与转录复合体相互作用模式图,2、反式作用因子中的DNA识别或结合域,如上图所示，作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域，DNA结合域：多由60100个氨基酸残基组织的几个亚区组成；转录激活域：常由30100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，以酸性结构域最多见；连接区:即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用于转录复合体而影响转录效率。,（1）螺旋转角螺旋(HTH)及螺旋-环-螺旋(HLH)这类结构至少有两个螺旋，其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA一个螺距(3.4nm)，两个螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟(图)。,HTH结构及其与DNA的结合,N-端多余臂部分与小沟结合,螺旋1和2靠在外侧,螺旋3位于DNA的大沟中,螺旋-转角-螺旋,（2）锌指(zinc finger)其结构如图所示，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2?个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。,（3）碱性亮氨酸拉链(bZIP)，该结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。,位于螺旋疏水区的亮氨酸相互作用,碱性区与DNA相结合,碱性区与DNA相结合,（4）碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)：bHLH类蛋白只有形成同源或异源二聚体时，才具有足够的DNA结合能力。该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。,（5）同源域蛋白（hd)：同源域是编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，同源转换基因与生物生长、发育和分化有关。许多含有同源转换区的基因具有转录调控功能，同源转换区氨基酸序列可能参与了DNA结合区。最早来自控制躯体发育的基因，其中的DNA结合区与螺旋转角螺旋相似，人们把该DNA序列称为同源域盒。主要与DNA大沟相结合。,四、真核基因表达调控的主要模式（真核基因表达调控举例）,现代分子生物学上把能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件（response element）。它们与细胞内高度专一的转录因子相互作用，协调相关基因的转录。最常见的应答元件有：热激应答元件（HSE），糖皮质应答元件（GRE），金属应答元件（MRE）,返回首页,1、蛋白质磷酸化与基因表达,蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。,已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。,受体分子活化细胞功能的途径：1、受体/受体结合蛋白具有内源蛋白激酶活性2、配体受体G蛋白介导真核细胞主要跨膜信号传导途径（P268）,蛋白激酶（PK）分类：根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸殘基种类分：（1）丝氨酸/苏氨酸型（2）酪氨酸型（3）组氨酸型根据是否有调节物参与蛋白激酶活性分：（1）信使依赖型（P269表）（2）非信使依赖型,蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用,(1).在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。(2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶活性。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。(3).对外界信号具有级联放大作用；(4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化。,2、热激应答激活蛋白,虽然所有应答元件与转录起始位点的距离并不固定，如HSE常位于启动区内，GRE则位于增强子区内。但它们大多位于转录起始位点上游200bp之内。尽管单个应答元件的存在足以调控基因表达，多拷贝元件的存在可能与基因的高效表达有关。特异转录因子与应答元件的结合，是起始该基因转录的必要条件。,许多生物受热诱导时能合成一系列热休克蛋白。无论细菌还是高等真核生物，热休克基因散布于染色体的各个部位或不同染色体上。受热后，果蝇细胞内Hsp70 mRNA水平提高1000倍，就是因为热激因子（heat shock factor，HSF）与hsp70基因TATA区上游60bp处的HSE相结合，激发转录起始。在第一个HSE上游800bp处还发现存在第二个HSE。研究发现，在没有受热或其他环境胁迫时，HSF主要以单体的形式存在于细胞质和核内。单体HSF没有DNA结合能力，Hsp70可能参与了维持HSF的单体形式。受到热激或其他环境胁迫时，细胞内变性蛋白增多，与HSF竞争结合Hsp70，从而释放HSF，使之形成三体并输入核内。,热激以后，HSF不但形成三体，还迅速被磷酸化。HSF与HSE的特异性结合，引起包括Hsp70在内的许多热激应答基因表达，大量产生Hsp70蛋白。随着热激温度消失，细胞内出现大量游离的Hsp70蛋白，它们与HSF相结合，并使其脱离DNA序列，最终形成没有DNA结合能力的单体。对果蝇和人HSF蛋白的分析表明，热激转录因子具有多个可形成拉链的疏水重复区，其中3个位于N端，靠近DNA结合区，参与促进HSF三体的形成。第4个拉链位于C端，与第452-488位保守区一道参与维持HSF的单体构象。无论是去除第4个拉链区，还是更换该区甲硫氨酸391赖氨酸，亮氨酸395脯氨酸，都会导致HSF突变体对HSE在常温下的高亲和力。删除第452-488位氨基酸，也可部分替代热激效应。,常温下，Hsp蛋白第1和4号拉链发生相互作用，从而阻断了三体的形成；热激或其他环境胁迫导致内源拉链之间的解离，蛋白质伸展成长链，不同链上的拉链发生作用，形成具有DNA结合能力的三体。Hsp70能够被热激或其他形式的胁迫迅速诱导，与变性多肽结合，防止形成不可逆聚集。在正常生长条件下，Hsp70主要作用于新生肽的从头折叠。严格的自装配除多肽的一级结构之外不需要其他任何因子，因为这些蛋白的正确结构形式在动力学和热力学上都是有利的。在辅助因子介导的自装配中，错误的结构比正确的结构更易形成。分子伴侣的结合可以通过设置障碍来阻止错误的装配，或通过降低正确装配所需根据活化能来促进这一过程的发生。,3、激素及其影响（简）,激素受体复合物与染色质特定区域结合，导致基因转录的起始或关闭。激素应答基因多为顺式作用元件，该序列有类似增强子的作用。激素、受体、顺式作用元件三者的结合才能发挥作用。三种假说：1、受体流动假说：激素受体复合物在膜内流动并激活环化酶，引发后续效应。2、中介物假说：膜脂或加入的磷脂物质为中介3、邻位互调假说：激素与GTP协同作用使腺苷酸环化酶几种不同构象之间发生互变,返回首页,五、其它水平上的基因调控,1、RNA的加工成熟 45S的前体rRNA，经切割、修饰为成熟的18S、28S、5.8S的rRNA。tRNA初级转录产物在细胞质后，经核苷的修饰。生成前体tRNA，再剪接为成熟tRNA 前体mRNA（hn RNA)经加帽、加尾、剪接、甲基化修饰等成为成熟的mRNA.,2、真核基因转录后加工的多样性,（1）简单转录单位只编码产生一个多肽，转录产物有或无加工。第一种简单转录单位，如组蛋白基因，无内含子，无转录后加工，3无poly(A),有回文序列为终止信号。第二种简单转录单位，如酵母蛋白基因，无内含子，m RNA无需剪接，需加poly(A)第三种简单转录单位，如多种蛋白基因，有内含子，需转录后加工剪接，3加poly(A)，只产生一个有功能的m RNA。,（2）复杂转录单位,含有复杂转录单位的主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因，它们除了含有数量不等的内含子以外，其初级转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的mRNA。,3.翻译水平的调控,（1）mRNA的“扫描模式”与合成起始AUG的前（5）和后（3）序列大多数为A/GNNAUGG，决定了起始复合物形成。通过“融合基因”方式产生多聚顺反子替代物，补偿真核生物核糖体不能利用多聚顺反子型mRNA来协调各种不同蛋白质合成的缺陷。（2）mRNA5帽子结构的识别与合成细胞中的帽子化酶同时具有RNA三磷酸酯酶和鸟苷酸转移酶活性，通过鸟苷酸转移酶生成55磷酸二酯键，从而形成加帽反应。,（3）mRNA稳定性控制 真核生物能否长时间、及时地利用成熟的mRNA分子翻译出蛋白质以供生长、发育的需要，是和mRNA的稳定性以及屏蔽状态的解除相关的。原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3min。高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均3h。在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达数天。,转运铁蛋白受体（TfR）和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒。这两个mRNA上存在相似的顺式作用元件，称为铁应答元件（iron response element，IRE）。IRE与IRE结合蛋白（IREBP）相互作用控制了这两个mRNA的翻译效率。当细胞缺铁时，IREBP与IRE具有高亲和力，两者的结合有效地阻止了铁蛋白mRNA的翻译，与此同时，TfR mRNA上3非翻译区中的IRE也与IREBP特异结合，有效地阻止了TfR mRNA的降解，促进TfR蛋白的合成。,（4）蛋白质因子的修饰与翻译起始调控,用兔网织红细胞粗抽提液研究蛋白质合成时发现，如果不向这一体系中添加氯高铁血红素，网织红细胞粗抽提液中的蛋白质合成抑制剂就被活化，蛋白质合成活性在几分钟之内急剧下降，很快就彻底消失。现已查明，网织红细胞蛋白质合成的抑制剂HCI是受氯高铁血红素调节的eIF-2的激酶，可以使该因子的-亚基磷酸化并由活性型转变为非活性型。,返回首页,第六、七章复习思考题1.什么是基因表达?试述基因表达变化的特点及其调控对生物体的重要性。2.为什么说转录起始的调控是基因表达调控的中心环节?3.举实际例子说明操纵元的组成元件及其作用，并分析可阻遏的操纵元和可诱导的操纵元的调控方式。4.比较真核和原核生物的基因表达和基因表达调控相似和不同之处，说明真核基因调控的复杂性表现在哪些方面？5.简述操纵子、启动子、转录因子、弱化子、增强子、前导肽、CAP、锌指的概念、结构、及功能。6、真核生物的顺式作用元件和反式作用因子各包括哪些？它们通过什么方式调控基因表达？,谢谢大家听课！,