猪血清IgG的分离纯化及鉴定.ppt
猪血清IgG的分离纯化及鉴定,组员：张 健 汤敏龙 陈玉玲汇报人：陈小坚,2,Contents,材料与方法,结果与讨论,总结与感想,3,一、材料与方法,（一）试验材料,1、供试材料,采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置1-2h，析出血清，于4、8000r/min离心10min，除去血球和纤维蛋白原后，取上层血清，-20冰箱内保存备用。,4,2、主要试剂,5,6,3、仪器设备,7,（二）试验方法,8,1、猪血清IgG的提取正辛酸法,准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中，加入60mmol/L pH4.0醋酸缓冲液160mL，用氢氧化钠溶液调pH4.5。以每毫升稀释液加入25L正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min，4，5000 r/min离心30min，弃去沉淀。上清液4预冷，以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min，5000r/min离心15min。将沉淀溶于20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为粗提IgG。,9,2、猪血清IgG的纯化,将上述IgG粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋，悬于装有0.01mol/L，pH7.4的PBS的大烧杯中，于磁力搅拌器上4透析24h，每6h换一次液。,（1）透析脱盐,10,取2g预处理的DEAE-52纤维素、装成1.530cm，柱床高25cm层析柱。缓冲液A(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8，35mmol/L NaCl)平衡。取2mL上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液A平衡，至流出液在280nm波长洗脱曲线变得平直止。以等量缓冲液A和缓冲液C(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8，500mmol/L NaCl)连续梯度洗脱；控制流速1mL/min。上样15min后分步收集并记录波峰，2mL/管，合并同一波峰收集管。再用PBS溶液透析，并进行分析鉴定。,（2）DEAE-52纤维素离子交换层析纯化IgG,11,3、提取液蛋白含量测定Folin-酚法,配制标准牛血清白蛋白进行Folin-酚法实验，用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280。以蛋白质的浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘制标准曲线。各粗IgG样品液定容至100mL，按Folin-酚法操作，通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。,12,4、猪血清IgG分子量测定SDS-PAGE,配制SDS-PAGE凝胶。将透析过的IgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热5min，各取20L加入凝胶板的样品槽中，进行电泳。取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，20min后用脱色液脱色。脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标样做出标准曲线计算样品IgG分子量。,13,电泳设备,14,二、结果与讨论,（一）正辛酸提取猪血清IgG试验结果,血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。,（二）猪血清IgG纯化结果,透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。,1、IgG的透析结果,15,保留时间0-1.6h为缓冲液A洗脱第一峰；1.6h开启缓冲液A-C线性梯度洗脱，获得第二峰；图示两色谱峰分离效果较好，分辨率高，无重叠。,2、DEAE-52纤维素层析纯化IgG结果,用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化，以OD280nm为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图：,16,图 福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线,（三）提取液蛋白含量测定结果,1、标准曲线,17,分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白质含量1.45mg/mL，高盐峰样品蛋白质含量为.74mg/mL。,2、样品IgG含量测定,18,（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果,猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：,1标准蛋白 2 猪血清 3 纯化的IgG样品,19,IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键，还原成两条单链，再进一步与SDS结合成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物，SDS-PAGE电泳呈现两条较浓的条带。猪血清球蛋白经正辛酸法提取，DEAE纯化后，所得IgG较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。,20,1、标准曲线制作,以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMw）为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下标准曲线。,21,2、IgG样品分子量测定结果,根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查出其相对分子质量如下：重链约55000，轻链约24000。即猪血清IgG球蛋分子量为16万左右，与文献蛋白质技术手册报道结果一致。,22,四、总结与感想,总的来说，本次试验还是成功的，虽然说试验方法在细节上还有很多需要改进的地方，但实验目的已经达到。本次实验课是一次不同于以往的自主性实验课程，需要我们自己查找资料、设计实验方案，更需要我们独立思考、通过团队合作完成实验。,23,这种以学生为主，老师为辅的实验课程让我们想得更多，学得更多，得到的也更多。在我们开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展提供了有力的基础。,24,谢 谢,
