背景知识六菌种保藏技术.ppt
背景知识六：菌种保藏技术,武汉职业技术学院,微生物技术应用,微生物会发生变化吗？分离得到的微生物可以直接用于生产吗？怎样保存微生物？,知识节点一 遗传变异的物质基础知识节点二 原核微生物的基因重组知识节点三 真核微生物的基因重组知识节点四 微生物育种技术知识节点五 菌种保藏技术,知识节点一 遗传变异的物质基础,遗传：变异：遗传型/基因型：表型：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。饰变：指微生物的某些改变是指不涉及遗传物质结构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,一、三个经典实验证实核酸是遗传变异的物质基础（一）经典转化实验：,2、细菌培养试验 热死S菌 不生长肺炎双球菌 活R菌 长出R菌 热死S菌+活R菌 长出大量R菌+10-6S菌,（二）噬菌体感染实验,（三）植物病毒的重建实验TMV重建实验示意图(箭头表示遗传信息的去向),二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式(一)细胞水平1 核染色体 2 质粒（1）致育因子（F因子）又称致育因子或性因子（2）抗性因子（R因子）又称R质粒（3）产细菌素因子（4）诱癌质粒（Ti质粒）（5）巨大质粒（mega质粒）（6）降解性质粒(二)分子水平核酸（DNA、RNA）,知识节点二 原核微生物的基因重组,基因重组：将两个不同性状个体细胞内的遗传基因移到一个个体细胞内，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传性个体的过程。获取外源DNA的方式原核微生物 转化 裸露的DNA基因重组的方式 转导 噬菌体作媒介 接合 细菌之间的接触相同：基因转移导致遗传重组,一、转化（一）定义 转化或转化作用：转化因子：具有转化活性的外来DNA片段 转化子：转化后出现了供体性状的受体细胞（二）转化微生物的种类 肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属）、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属和黄单胞菌属,（三）转化的条件能进行转化的受体细胞必须处于感受态，同时有外源DNA片段存在，才能实现其转化。（四）转化过程（五）与转染区别）,抗链霉素基因strr,链霉素敏感型基因strs,二、转导完全缺陷噬菌体：转导噬菌体/转导颗粒 部分缺陷噬菌体：转导子：获得新遗传性状的受体细胞,（一）普遍转导 1 完全普遍转导,2 流产转导,（二）局限转导 1.低频转导（LFT）部分缺陷噬菌体的形成当部分缺陷噬菌体感染宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时，可使宿主细胞成为一个局限转导子（而不是一个溶源菌，对噬菌体不具有免疫性）。,2.高频转导（HFT）当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常噬菌体的基因可补偿dgal所缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。因此由双重溶源菌所产生的裂解物中，含有等量的和dgal粒子，这就称HFT（高频转导）裂解物,（三）普遍性转导和局限性转导的比较,三、接合（一）定义 接合：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。接合子：通过接合而获得新性状的受体细胞。,（二）Ecoli的四种接合型菌株,（三）几种杂交的结果：1.F+与F-的杂交 杂交的结果：供体菌和受体菌均成为F+细胞 没有供体菌染色体DNA的转移 2.Hfr 与F-的杂交 杂交后的受体细胞仍然是F-部分供体菌DNA染色体转移到受体菌中 3.F与F-杂交 受体细胞也就变成了F 部分宿主细胞的DNA随F因子进入受体菌细胞,（四）原生质体融合 是将遗传性状不同的两种菌融合为一个新细胞的过程 主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子的选择等步骤。,知识节点三 真核微生物的基因重组,一、有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术 二、准性生殖 是一种类似于有性生殖，但比有性生殖更为原始的一种生殖方式，它可使同种物两个不同菌株的体细胞发生融合，并不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程,准性生殖和有性生殖的比较,知识节点四 微生物育种,微生物菌种选育途径：自然选育、定向选育、诱变育种、杂交育种 一、利用自发突变进行的育种（一）自发突变原因 1.环境因素对微生物的诱变作用 各种短波辐射和高温等 2.DNA复制 3.微生物自身产诱变物质,（二）自发突变与育种 1.自然选育 在日常生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程 2.定向育种 是指在某一特定条件下，用某一特定因素长期处理某微生物的群体，同时不断地对它们进行移种传代，以积累自发突变，并最终获得优良菌株的过程,二、诱变育种 指用人工的方法处理均匀而分散的微生物细胞群，促使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用（一）诱发突变原因诱变剂 1.物理因素的诱变（1）紫外线（2）x射线和r射线（3）热和激光等,2.化学因素的诱变（1）碱基结构类似物 5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）（2）与核酸上碱基起化学反应的诱变剂 结果使A H（次黄嘌呤）G X（黄嘌呤）C U（尿嘧啶）（3）移码突变,（二）诱变育种诱变育种的基本过程如图：1.诱变育种的基本过程操作方法,2.产量突变株的筛选,3.抗药性突变株的筛选抗药性基因：选择性遗传标记、重要的生产菌种。筛选方法：（a）梯度平板法：梯度平板法定向筛选抗异烟肼的吡多醇高产酵母菌突变株,（b）影印平板培养法,4.营养缺陷型突变株的筛选（1）营养缺陷型（2）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基 基本培养基MM-：完全培养基CM+：补充培养基SMA/B：（3）与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体,（4）营养缺陷型的筛选方法,夹层培养法及其结果,影印接种法及其结果,知识节点五 菌种保藏技术,一、菌种衰退和菌种的复壮1、什么是菌种的衰退？2、菌种衰退有怎样的表现？3、菌种退化的原因是什么？4、如何防止菌种衰退？5、如何复壮菌种？二、菌种保藏1、菌种保藏的目的是什么？2、菌种保藏的原理是什么？3、常用的菌种保藏方法有哪些？各如何操作？,一、菌种衰退和菌种的复壮1、菌种衰退：指生产菌株性状的劣化或遗传标记丢失的现象。,纯菌种,自发突变,突变个体,传代增殖,原始个体,不纯菌种,衰退菌种,2、菌种衰退表现 菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等,3、菌种衰退的原因基因变异主要原因菌种衰退的基本原因是有关基因发生负突变，连续传代加速衰退 不适宜的培养和保藏条件加速衰退,4、菌种衰退的防止 控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不易衰退的细胞移种传代 采用有效的菌种保藏方法 讲究菌种选育技术 定期进行分离纯化,5、菌种的复壮狭义的复壮消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和典型性状、生产性能等指标测定，从中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。广义的复壮积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。,菌种复壮的主要方法纯种分离法：分离仍保持原有典型性状的单细胞淘汰法：处理（如药物、低温、高温等）衰退菌种，淘汰已衰退个体遗传育种法：退化的菌种重新进行遗传育种宿主体内复壮法：对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应宿主体内来提高菌株的毒性,二、菌种保藏菌种保藏是一种保持微生物菌株的生活力和原有性状的方法。1、菌种保藏的目的菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不被污染、不变异变异不可避免,但可减缓变异速度。,2、菌种保藏的原理人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于休眠状态挑选典型菌种的优良纯种进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等,3、常用的菌种保藏方法,菌种保藏技术,（1）斜面低温保藏法（2）蒸馏水保藏法（3）真空冷冻干燥保藏法/冷冻干燥保藏法（4）液氮冷冻保藏法,（1）斜面低温保藏法常用保藏法 菌种在适宜的斜面上 4冰箱中 生长完全 保藏 每隔一定时间（保藏期 1-6个月）后 新的斜面上 4 生长 保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏,此法的主要保藏措施是低温。原理是低温抑制生长。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。螺旋口试管替代传统的棉塞、减少培养基碳水化合物的含量,（2）蒸馏水保藏法：菌种制备 蒸馏水灭菌 接入菌种 不要沾湿棉塞 塞紧 室温保藏螺旋口试管或加橡皮塞试管 10 或18可保藏1年左右适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。思考：原理、优缺点、改进,其原理是对菌丝体造成营养饥饿，从而抑制菌丝的生长。简便，使用方便，取后剩余可继续保藏也可用不含养分的溶液如0.25M磷酸缓冲液（Ph6.5）或生理盐水,（3）真空冷冻干燥保藏法/冷冻干燥保藏法，简称冻干法：一般菌种可保存5年-15年。除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状真菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%（霉菌、蕈菌、藻类）。,安瓿管 菌种菌种要纯 配制保护剂如脱脂牛奶、海 藻糖、血清白蛋白、糊精 酸洗、水洗 培养生长良好 分装 烘干 制备菌悬液浓度应高 灭菌 灭菌 分装安瓿管 预冻低温冰箱20-60m或冷冻剂5-10m至-30 真空干燥在30m内达到93.3Pa（0.7mmHg）装在歧管上抽真空慢干至26.7Pa0.2mmHg 火焰上熔封安瓿管口 检测真空 保藏冰箱或室温暗处,冷冻干燥保藏管 一种简易冷冻干燥装置 思考：原理、优缺点,是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的方法冷冻干燥保存的菌种存活时间长、变异率低、效果好，便于大量保藏，还具有体积小、不易污染、便于运输等优点缺点是设备和操作都比较复杂。,（4）液氮冷冻保藏法：原则是“慢冻快融”许多细菌可保藏15年以上。此法除适宜于一般微生物的保藏外，一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都适用,准备安瓿管 加保护剂与灭菌能耐受温度突然变化 霉菌菌丝体：安瓿管内预先加入保护剂 接菌种入安瓿管细菌10的甘油蒸馏水菌悬液 霉菌菌丝体用灭菌打孔器切取菌落圆块 用火焰熔封，浸入水中检查 冻结以每分钟下降1的慢速冻结至-30 保藏立即放入液氮冷冻保藏器内（气相为-150，液态氮内为-196）,恢复培养：需用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水浴中震荡，1分钟内全部融化。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养防爆炸、防冻伤，要戴皮手套操作。,低于-130微生物代谢停止，处于休眠状态优点：保藏期长、变异率低、效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛 缺点：需要特殊设备、液氮消耗较多费用较高,4、菌种保藏机构美国标准菌种收藏所 ATCC采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。中国微生物菌种保藏委员会CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。,ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图至少在20年内，获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代,
