正常细胞的培养技术mia.ppt

第五章 正常细胞的培养技术,正常细胞，不论是来自人或动物的细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难，因为它们是已分化的细胞，对体外生存条件要求严格，目前体外模拟的培养条件都还达不到与体内相一致的要求。正常细胞在体外并非不能培养，只要各种条件适当仍然有培养成功的可能，初代培养较传代细胞系容易。,正常细胞培养可用于许多方面，如研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响，作为 观察和检测手段研究活细胞的变化（变异、分化），可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达，也可大量培养用于生物制品的生产，等等。,一、上皮细胞培养上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层，其中来源于内外胚层的上皮细胞可呈膜状生长。不同器官的上皮细胞均具有不同的特定的功能，培养上皮细胞不仅有利于研究其功能，还可为烧伤、烫伤的皮肤进行上皮膜层移植，加速伤口愈合，不留疤痕，在皮肤美容方面也具有潜在的应用价值。,上皮细胞培养有三个难点：需特殊底物 如需在底层涂以胶原或铺上饲养层细胞，以利于生长。需特殊的培养液 如加浓缩维生素及氨基酸的EMEM及KGM（培养消化上皮细胞）、EGM（培养一般上皮细胞）等，价格昂贵。与上皮细胞混杂的成纤维细胞的过度生长，常常干扰上皮细胞在体外的培养使其难以长期生存。,为此，需要从表皮分离、培养液和基质底物的选择、增加适当生长因子等方面着手，以抑制成纤维细胞生长，促进上皮细胞生长。由此可见，要纯化和延长上皮细胞生存期，抑制成纤维细胞生长或去除（或减少）成纤维细胞是上皮细胞培养成功的关键。,(一)表皮细胞分离与培养皮肤是表皮细胞的重要来源，小儿阴茎包皮是表皮培养的好材料。目前，全皮培养混有大量成纤维细胞，因而不采用，常采用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞。,（1）无菌条件下切取皮肤标本，以角化层薄者为佳，早产、流产胎儿皮肤更好。（2）将皮块置于消化液中进行消化，此时表皮层与真皮层自然分离，表皮层为浅棕色，真皮层为白色。（3）取出表皮层再进行第二次消化。（4）待充分消化后，剪碎移至瓶内加入适量培养液，吹打分散制成细胞悬液，用不锈钢纱网过滤，调整细胞浓度，用含15%胎牛血清的培养液进行分瓶培养，3天后可见大部分上皮细胞贴壁生长。,(二)乳腺上皮细胞分离培养乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集上皮细胞，培养时常用人胚小肠成纤维细胞作饲养层可抑制间质细胞生长。,(1)取材，于产后27天收集乳汁1:1的比例与培养基混合。(2)低速离心，仔细去除上清，收集细胞。(3)细胞洗涤后置于培养瓶中培养。(4)35天更换培养基，待细胞长满后可消化、传代。,(5)用乳腺细胞培养上皮细胞时，注意：应尽可能去除脂肪组织，如果标本中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获取细胞，初时有巨噬细胞存在，可作饲养层细胞，培养时也可用经照射或用丝裂霉素C处理过的3T3细胞作饲养层细胞，或用胶原层，培养液中也可加刺激生长因子如EGF、胰岛素、氢化可的松、猪促乳素和前列腺素E1等，有利于细胞生长繁殖。,表皮细胞生长融合成片，并向复层发展,表皮细胞贴壁生长，呈多边形，不规则,(三)子宫颈上皮细胞分离培养子宫颈上皮细胞体外培养在细胞癌前病变及致癌的研究中有重要意义。常用组织块法进行原代培养，传代培养需用经照射或丝裂霉素C处理的3T3细胞作滋养层。培养液需添加适当的刺激生长的添加物。,（1）收集活检标本，尽可能防止污染。（2）洗涤、剪碎，去除纤维组织。（3）37培养10天以上，组织块贴壁，加入EGF并用此培养液换液。（4）消化、分散、传代培养。,(四)肝细胞分离培养可用组织块法和原位灌注消化法收获肝细胞进行原代培养，其形态规则，适于作多种功能的研究。肝脏原位灌注消化法：从门静脉或其分支中插管，用无钙、镁PBS冲洗肝脏15分钟，然后用胶原酶液灌注15分钟，使纤维组织网被消化，经过23次离心分离，可获得大量肝细胞悬液。培养时可将肝细胞接种在游离漂浮的胶原薄片上，细胞能较好地表达其功能。,(五)胰腺细胞分离将获取的胰脏标本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，经过3次离心分离收集细胞，在水浴槽中用旋转法使细胞聚集（224h），接种涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养的胰腺细胞。此法可用于家鼠和人胰腺细胞培养，培养时采用照射过的肺成纤维细胞作为饲养层，效果更佳。,(六)气管及支气管上皮细胞分离培养在血清存在条件下，正常人气管上皮细胞停止分裂和生长分化，因此需用无血清培养基(LHC-9),可使组织碎块的气管上皮细胞生长，并且抑制纤维细胞生长。,(七)前列腺细胞培养前列腺细胞的培养，关键是改良培养液的成分，加入激素样生长因子，以刺激前列腺细胞生长，抑制纤维细胞生长，可用于研究前列腺的生长和功能。,(八)口腔粘膜上皮细胞培养口腔粘膜上皮为复层鳞状上皮，体外培养口腔粘膜上皮细胞的关键是：用胶原酶消化法使鳞状上皮细胞层与底层的间质分开，再进一步用胰蛋白酶消化法使鳞状上皮细胞分离为单细胞悬液，然后在角化细胞培养液(KGM)中培养。,(九)胃上皮细胞培养培养正常人胃上皮细胞对研究胃癌癌变机理有很大应用价值。但培养难度大，培养成功要注重三点：第一，用胶原酶和透明质酸酶消化法，并用消化细胞；第二，应用胶原底物培养；第三，制备含有特定成分的培养基。胃上皮细胞培养多加血清并不能促进细胞生长，可能与血清中含有抑制上皮细胞生长的TGF-1有关。完全培养基中添加的许多种成分和生长因子，可利于上皮细胞生长，而且呈现对胞外基质ECM的依赖性，尤以型胶原对胃上皮细胞作用更好。,二、中胚层细胞培养,中胚层细胞培养包括结缔组织、肌肉组织、骨组织、骨髓细胞、内皮细胞、血细胞等的培养。,(一)结缔组织细胞在细胞培养中包括人在内的结缔组织细胞(如成纤维细胞等)都很容易培养成功，也是其他组织培养时的副产物，无需特殊的培养条件，常规培养即可。其生物学特性稳定，不易发生转化，成为二倍体细胞的主要来源，人的二倍体细胞系主要为成纤维细胞。为获取大量成纤维细胞，用人和动物胚体为好。动物可用鼠胚或鸡胚，人胚可取皮肤(包皮或胎儿皮肤)、肺、肾，这些都是很好的研究和应用对象。,1、人胚肺细胞分离培养人胚肺细胞可建立二倍体细胞系，可用于病毒疫苗的生产和研究，还可用来生产-干扰素(IFN-)等生物制品。传代培养能稳定生长，但有寿命限制，一般可连续传至6515代左右。染色体数为2n=46条，通常以1:2传代后，一周内可形成单层，其形态和生长特性稳定，无致瘤性，对某些病毒敏感，但本身无潜在病毒和支原体污染。国际公认的人胚肺二倍体细胞系为WI-38和MRC-5等。,人胚肺细胞的分离和培养方法如下：(1)取妊娠35个月人工流产的正常胎 儿，无菌取肺组织。(2)洗涤、剪切、消化，常规培养，注 意观察细胞的形态、密度变化，及时换液、传代。,2、人胚肾细胞分离培养人胚肾细胞利用肾脏的皮质细胞经胰蛋白酶消化分散后制成，该细胞呈类梭形，细胞界限较模糊，消化时间要控制好，原代培养时血清浓度以20%为宜，贴壁较牢固，传代培养时，消化时间可适当延长。细胞来自于妊娠35个月人工流产的正常胎儿，无菌取得。,3、人羊膜细胞分离培养人羊膜细胞目前已建立了细胞系，通过转化后，可以无限制传代，常用FL、Wish人羊膜细胞分离、繁殖某些病毒，并用来测定干扰素的效价。正常的人羊膜细胞也易于培养。细胞来自于剖腹产、顺产胎儿或新生儿的胎盘中的羊膜。,4、实验室也经常使用幼地鼠肾细胞、鼠胚及地鼠胚成纤维细胞、鸡胚纤维母细胞等，这些细胞的分离培养与人细胞的分离培养基本方法是一样的。,(二)肌肉组织细胞骨骼肌、心肌和平滑肌细胞都可在体外培养中生长，心肌细胞在培养的最初几天还具有自动节律性收缩功能，传代培养时可能会逐渐丧失这种功能。平滑肌细胞可通过胰蛋白酶或胶原酶消化法从血管气管壁及肠壁中获得。骨骼肌可从四肢中获得。肌细胞含有数种抗原标记物，如肌浆球蛋白、原肌凝蛋白等。肌动蛋白等可在大多数细胞中发现，但并非细胞的特有标记物，肌细胞分化时肌酸磷酸酶活性升高。,1、骨骼肌细胞分离培养动物胚或幼体四肢，特别是大腿肌组织为最好的培养材料，取材常用生后12天的乳鼠（Wistar大鼠更好）。人骨骼肌细胞来源最好是人工流产的孕期为35个月的健康胎儿肢体。,无菌取肌组织，洗涤、剪切、消化。常规培养，注意观察细胞形态、数量的变化，及时换液、传代。肌肉细胞成片后，可用胰蛋白酶消化分散，进行传代培养，可传1020代。,2、心肌细胞培养心肌组织是最早利用的培养材料之一，最常用的是孵育1012天的鸡胚心肌，新生大鼠、乳鼠及人胎儿心肌等。心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如悬滴培养、组织块培养和消化培养法等。主要是取心室肌培养，消化分离方法与前相同。,(三)各种骨细胞分离培养,包括软骨细胞分离培养、成骨细胞分离培养和破骨细胞分离培养等。,1、软骨细胞分离培养软骨分为生长部和休止部，其中生长部软骨细胞在体外培养条件下代谢较活跃，具有形成软骨基质的功能和成骨细胞的某些特性。软骨细胞埋藏于致密的糖蛋白软骨基质中，必须经过一系列酶消化,才能获得少量细胞，在呈弱碱性并增加Mg+浓度的培养液中易于生长。,操作要点是：切碎软骨组织，用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶消化两遍以除去基质，再用胶原酶长时间消化，收集细胞，按常规贴壁单层细胞培养法，培养于弱碱性的F12培养液中。体外培养的软骨细胞，很像上皮样细胞，可形成具有折光性的细胞外基质，经甲苯胺兰染色呈异染性。细胞组织化学染色：软骨细胞可以特异性合成葡萄糖胺聚糖(GAG),型和型胶原，并具有碱性磷酸酶活性(免疫组化阳性)，也可用定量法测出其含量。,2、成骨细胞分离培养骨细胞是一种终末化的细胞，埋藏于骨基质中，从皮质骨中分离培养骨细胞至今未见报导，只是在胎鼠或鸡胚颅骨细胞培养时见到少量星状细胞，呈花边样网状结构。在某些激素(如甲状旁腺素)的作用下或无血清培养中，这些细胞可变为圆形，二羟基维生素D3可以刺激某些成骨样细胞变为星状。骨细胞可以和成骨细胞一起从胎鼠或鸡胚颅盖骨上分离出来，也可由体外培养的成骨细胞分化而来，OB7.3阳性的细胞刚分离时为圆形，贴壁生长变为星形，具有胞浆突起，数日后胞突连成网状，使星形细胞相互连接，不依赖于细胞外基质。,成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理，并经胶原酶消化，均可分离培养出成骨细胞，体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特性。,3、破骨细胞分离培养破骨细胞的研究表明，脾脏和骨髓中单个核细胞可以互相融合形成多核的破骨细胞，随血流到达破骨细胞活动活跃的部位，在新生动物的长骨内面反复冲洗或用胶原酶消化，新生动物的颅盖骨都可获得破骨细胞，用骨髓培养法也可使单个核细胞分化为破骨细胞。,(四)骨髓细胞的分离培养骨髓可分为造血干/祖细胞和基质细胞两类，均可在体外进行培养，扩增和开展细胞定向分化的研究。,骨髓基质细胞在骨髓中可为造血干/祖细胞提供微环境，可分泌许多种细胞因子，对造血干/祖细胞的分化起着独特的支持作用。此外，骨髓基质细胞还与成骨效应密切相关，目前认为骨髓基质细胞有内皮细胞、平滑肌细胞、网状细胞、脂肪细胞或骨细胞和破骨细胞等，因此，对开展成骨效应、成骨细胞分化和上述各类细胞的分离、鉴定及其功能的实验研究，已引起科研人员和临床医生的极大兴趣。体外大量扩增骨髓基质细胞应用于临床治疗骨不连及软骨缺损具有广阔的应用前景。,1、骨髓细胞来源新生动物及胚胎骨的骨髓，人和胎儿的骨髓，成人取自术后骨，胎儿取自流产胎儿骨的骨髓或临床上抽骨髓检查时剩余的骨髓或自愿供骨髓者。2、骨髓细胞的分离培养骨髓中的细胞，一类为不能贴壁、在培养基中悬浮生长的造血干/祖细胞、淋巴细胞、红细胞，另一类为能缓慢贴壁生长的骨髓基质细胞，这两类细胞不仅形态上有明显差异，而且分离培养方法、条件以及功能应用性研究也有所不同。,体外培养的骨髓细胞中红系集落形成单位（CFUE）,体外培养的骨髓细胞中单核巨噬细胞集落形成单位（CFUGM）,培养4d的骨髓基质细胞伸展生长、呈长菱形肌样外观,培养1周的骨髓基质肌样细胞（网状）,悬浮生长的造血干/祖细胞，若在骨髓培养的细胞中加入不同细胞因子，如G-CSF或M-CSF或EPO，同时均加入IL-3、IL-6，在软琼脂和甲基纤维素半固体培养基的24孔板中可形成不同的集落，这种试验既可用于测定细胞因子的效价，又可检查骨髓细胞的造血功能，同时也可从细胞中抽提总RNA，通过RT-PCR，可克隆相应的基因。此外，还可用于测定对化疗药物的敏感性和耐药性。,这些细胞在多种细胞因子的作用下，其中的造血干细胞在体外既保持其分化潜能又大量扩增，可用于骨髓移植。,经体外培养贴壁的骨髓基质细胞，可用于细胞因子自分泌和诱导分泌能力的测试。骨髓基质细胞能分泌多种调节免疫和造血功能的细胞因子，证明基质细胞能支持造血、提供造血微环境，也为体外扩增干细胞用于骨髓移植提供了新技术、新方法。扩增的基质细胞不仅可直接应用于临床治疗骨髓抑制、成骨能力障碍性疾病，而且可通过基因导入法开展基因治疗的研究。,（五）内皮细胞的分离培养内皮细胞在血管内形成单层内表面，标本来源多为牛主动脉、牛肾上腺皮质毛细血管、鼠脑皮质毛细血管、人脐静脉以及人皮肤和脂肪的毛细血管。采用血管内注入胶原酶的灌流消化法，可使内皮细胞分离，然后培养在铺有明胶基质的培养器皿中，如果标本来源是毛细血管，培养时需加入有丝分裂原，若来源于大血管则不用加。内皮细胞易于从血管分离进行培养成单层，对研究内皮细胞再生长、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大应用价值。,(六)血液细胞分离培养正常血细胞在体外培养生长时间短，只有白血病、血友病、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系，但多半为EB病毒等致瘤病毒引起的转化细胞(EBNA检查阳性)，DMSO处理也可诱导这些细胞分化发生逆转，转化为正常细胞。所建立的细胞系多半为单核细胞系、B淋巴细胞系、T淋巴细胞，在IL-2产品问世后，T细胞也可在体外建系、建株。,血细胞可从外周血中用梯度分离液通过离心分层后分离获得，也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞，从腹腔刺激后的冲洗液中可获得多量的单核一巨噬细胞，从骨髓中可以获得前体血细胞，并可长期培养生长，加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖。,1、外周血细胞分离培养外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离白细胞、淋巴细胞、血小板的重要来源。其分离方法有四种：即自然沉降法、差异沉降法、氧化分离法、Ficoll分层法。,Ficoll分离法 采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同比重将其分离开，如分离淋巴细胞可选用比重1.077的分离液，若分离血小板可用比重1.090的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用1.120比重的分离液。,外周血中淋巴细胞的分离,1500rpm,20,30min,2、淋巴器官中的淋巴细胞的分离从人脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液，在免疫学研究中是经常需要的。将淋巴器官剪成碎块，用镊子压挤或在金属丝网上研磨，或用玻璃匀浆器研磨，制成悬液，再用Ficoll分离法分离细胞，洗涤、计数，备用。,用上述分离法所获得的细胞、淋巴细胞，可用于白细胞粘附移动试验、转化试验、细胞毒试验，同时用于细胞因子的诱生和制备，或扩增外周血造血细胞、树突状细胞、LAK细胞、T细胞等，供细胞移植用。,3、人脐带血细胞分离培养人脐带血来源方便，脐血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质，具有刺激和促进骨髓造血干/祖细胞增殖、分化和再植能力，是造血生长因子的重要来源。脐血中富含类似于骨髓的造血干细胞，具有很强的自我复制和再植能力。脐血中还含有类似于骨髓的基质细胞，对骨髓造血具有支持作用，在体外培养扩增中具有更大的增殖能力，是造血干细胞移植的理想来源，已被应用于许多血液病和恶性肿瘤的治疗，并容易获得骨髓造血功能的重建。目前，不少单位建立脐血库，以不断满足研究和临床应用。,4、巨噬细胞分离培养巨噬细胞是免疫应答中重要的APC和非特异性吞噬细胞，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。该细胞易得、易培养。人巨噬细胞难以长期生长，多用作初代培养。巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血液和透析液等，实验动物多从血液、肺、脾和胸腹腔获取，通常采用预洗注入刺激物后再采集，以小鼠腹腔取材法最为实用。,三、神经外胚层细胞培养神经组织主要由神经细胞（神经元）和神经胶质细胞组成。神经元为高度分化的细胞，已失去增殖能力，对生存条件要求高，只有在适宜情况下，和经特殊处理的器皿中方可生长。神经胶质细胞较易培养，它分为少突、星形和小胶质三种。,(一)神经原细胞分离培养从出生48天的大鼠脑组织取材培养，培养液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神经元细胞，可获得特征明显的脑神经细胞。,(二)神经胶质细胞分离培养与神经元细胞相比，神经胶质细胞较容易在体外培养生长。用常规的组织块法、胰酶消化法、胶原酶消化法都可从幼年或成年动物及人的脑组织标本中培养出神经胶质细胞，而且生长稳定，不易发生自发转化，可建立起能传代的二倍体细胞系。,(三)黑色素细胞分离培养黑色素细胞来源于神经嵴的树突细胞。黑色素细胞是在皮肤表皮细胞培养的基础上发展起来的，黑色素细胞培养对研究和治疗色素异常性皮肤病(如白癜风)有重要意义。其基本原理和方法是：用胰蛋白酶消化法使表皮和真皮分离，用机械法从表皮的内面获得黑色素细胞，在添加适当成分的培养基中培养。黑色素细胞具有产生黑色素的功能，多巴胺反应呈阳性。,