植物细胞工程.ppt

第二节 植物细胞工程,第二节 植物细胞工程,一 植物组织培养二 植物细胞培养三 植物原生质体培养与融合四 人工种子的研制五植物种质资源离体超低温保存六 植物细胞工程研究进展（综述）,一 植物组织培养（Plant tissue culture）,（一）重要概念（二）对植物组织培养实验室的要求（三）植物组织培养的步骤（四）植物组织培养的主要阶段,（一）重要概念,植物细胞全能性（CellTotipotency）：指任何具有完整细胞核的植物细胞（不管性细胞还是体细胞），都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在特定的环境下能进行表达，产生一个独立完整个体的能力。满足两个条件：离体；给予适当的刺激经历两个过程：脱分化；再分化,愈伤组织的诱导,由愈伤组织分化成幼苗,（一）重要概念,植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官（根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚乳、皮层、髓组织等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、丛生芽或长成新的完整的植株的一种实验技术。由于在试管内培养，且培养的是脱离植株母体的培养物，所以也叫“离体培养”（Culture in vitro）或“试管培养”（In test-tube culture）。,（一）重要概念,外植体(Explant)：植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。愈伤组织(Callus)：外植体产生的排列疏松、无规则且没有发生分化的薄壁细胞。脱分化（dedifferentiation）：原来已经分化，并且具有一定功能的体细胞(或性细胞)，丧失了原有的结构和功能，又重新恢复分裂功能，就叫做植物细胞的脱分化。,（二）对植物组织培养实验室的要求,化学实验室或培养基配制室 洗涤室或消煮室 无菌室或接种室 培养室 观察与鉴定室 温室或苗圃 贮存室,培养室,接种室,观察与鉴定室,大棚,（三）植物组织培养的步骤,1.培养基（Culture medium）配制2.灭菌3.接种4.培养 5.试管苗驯化移栽 6.试管苗增殖率的估算,1.培养基的配制,（1）一个完善的培养基成分：无机营养成分：大量元素：浓度大于0.5mmol/L，包括H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等元素（配成母液）微量元素：其浓度小于0.5mmol/L，微量元素包括Cu、Mo、Zn、Na、Mn、CoB和I等（配成母液）铁盐：采用硫酸亚铁和EDTA-Na2结合成螯合铁配置而成（配成母液）,有机营养成分：（配成母液）碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖节约成本，一般的使用浓度为2%4%。植物生长调节物质（常称为激素）：配成母液 生长素：NAA、IAA、IBA、2，4-D；细胞分裂素：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2-iP（2异戊烯腺嘌呤）和TDZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3）；脱落酸（ABA）；多效唑（PP333）水：,（2）培养基的种类：按培养基组成特点分类第一类为含盐量高的培养基，如MS、LS、BL、ER。第二类为硝酸钾含量高的培养基，如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基，如Nitsch培养基。第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE培养基。,按培养基的功能分类 脱分化培养基分化培养基 壮苗培养基 生根培养基初代培养基继代培养基,（3）怎样选取最佳培养基方案（例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Agar0.6%）对于某个待培养的目的植物来讲：查资料预备性试验观察培养物的反应调整单因子试验，多因子试验和正交设计-逐步添加和逐步排除 基本培养基的选择 激素的选择：激素种类、浓度、激素配比 糖的选择：糖的种类、浓度的选择 琼脂的选择：主要是浓度的选择 附加物的选择：香蕉汁、活性炭、椰子汁等,（4）培养基的配制方法（药品室进行）MS+6-BA0.5+NAA1+Agar0.6%500 mL水+母液：激素或其他成分：如活性碳等 糖类：一般30g/L 琼脂：一般68g/L 加热溶化：pH值调整：定容：分注、封口：灭菌：,2.灭菌,（1）湿热灭菌：培养基及布制品的灭菌 几种排气的方法：时间与体积的关系：放气方法：,2.灭菌,（2）灼烧灭菌：用于无菌操作的器械 95%的酒精+酒精灯火焰上灼烧接种器杀菌器，如图（3）过滤灭菌：不耐热的物质,2.灭菌,（4）干热灭菌：玻璃器皿及耐热用具等。（5）紫外线和熏蒸灭菌：空间灭菌所用（培养室、接种室等）。（6）一些物体表面用药剂喷雾灭菌。（7）消毒剂表面灭菌：植物材料（超净工作台上，接种室）消毒剂的因素 外植体消毒步骤,消毒剂因素,外植体消毒步骤,材料自来水蒸馏水75%酒精3060 s 无菌水34次10%次氯酸钠或次氯酸钙饱和液或0.10.2%升汞（吐温）515 min 无菌水洗58次。,3.接种（接种室）,4.培养 Culture（培养室）,（1）培养方法 固体培养法液体培养法,4.培养 Culture（培养室）,（2）培养条件与环境条件：温度（Temperature)、湿度（Humidity)、光照光质（Light wave)、光强（Light intensity)、光周期（Light period)渗透压（Penetrating pressure)气体（Gas),5.试管苗驯化移栽,（1）试管苗与大田苗在生理、形态等方面的差异 异养型自养型无菌 有菌（2）管理：保持小苗的水分供需平衡。防止菌类滋生。一定的温、光条件，保持基质适当的通气性。,人工气候室,6.试管苗增殖率的估算,（1）基本数据的统计 每一周期（从接种当天到再次可供接种的当天）需要多少天 每一周期每一瓶能接种多少瓶 每瓶有多少苗,6.试管苗增殖率的估算,（2）计算年增殖率的理论值年增殖率：Y；每周期增殖的倍数：X；全年可增殖的周期数：n=365/每一周期的天数；Y=Xn,葡萄葡萄科,茶树山茶科,麻疯树大戟科,仙茅石蒜科,油樟（樟科）,生姜|姜科,兰草（兰科）,烟草,麻疯树,芦荟,兰草,（四）植物组织培养的主要阶段,1.预备阶段2.诱导去分化阶段3.继代增殖阶段4.生根发芽阶段5.移栽成活阶段,1.预备阶段,（1）选择合适的外植体是本阶段的首要问题.外植体，即能被诱发产生无增殖系的器官或组织切段，如一个芽，一节茎。选择外植体，要综合考虑以下几因素：,大小适宜：外植体的组织块要达到2万个细胞(即5-10mg)以上才容易活。同一植物不同部位的外植体的分化能力、分化条件及分化类型有很大差别。植物胚与幼龄组织、器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量愈伤组织。不同物种相同部位的细胞分化能力可能大不一样。总之，外植体的选择，一般以幼嫩的组织或器官为宜。此外，外植体的去分化及再分化的最适条件都需进行摸索，他人成功的经验可供借鉴，并无快捷方式可循。,（2）除去病原菌及杂菌消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关(表3-1)。,选择外观健康的外植体，尽可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。通常幼嫩材料处理时间比成熟材料要短些。对外植体除菌的一般程序如下：外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。,(3)配制适宜的培养基不同物种，外植体有差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下三大类组分：含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达每升30g，以及氮、磷、钾、镁等；微量无机物，如铁、锰、硼酸等；微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。一般较高的生长素(吲哚乙酸)对细胞分裂素(激动素)比值有利于诱导外植体产生愈伤组织，反之促进胚芽和胚根分化。,2.诱导去分化阶段,外植体是已分化成各种器官的切段。组织培养的第一步就是让外植体去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态。因此培养基中应添加较高浓度的生长素类激素。诱导外植体去分化可以采用固体培养基(在培养基中添加琼脂0.81.0)，这种方法简便易行、占地面积小、可在培养室中多层培养。外植体除菌后，切小片(段)插入或贴在培养基上即可。,但外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅，愈伤组织易出现极化现象是固体培养基的主要缺点。如把外植体浸没于液态培养基中，营养吸收及物质交换便捷，但需提供振荡器等设备，投资大，且染菌后难以挽回。本阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。但人们通常还是把它们置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。,（乳）白色愈伤组织,绿色愈伤组织,3.继代增殖阶段,愈伤组织长出后经过46周的迅速细胞分裂，原有培养基中的水分及营养成分多已耗失，细胞的有害代谢物已在培养基中积累，因此必须进行移植，即继代增殖。同时，通过移植，愈伤组织的细胞数大大扩增，有利于下阶段收获更多的胚状体或小苗。,继代增殖苗,4.生根发芽阶段,愈伤组织只有经过重新分化才能形成胚状体，长成小植株。所谓胚状体指的是在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。通常要将愈伤组织移置于含适量细胞分裂素，没有或仅有少量生长素的分化培养基中，才能诱导胚状体的生成。光照是本阶段的必备外因。根据实验工作的需要，有时也可不经愈伤组织阶段而直接诱导外植体分生、分化长成一定数量的丛生芽，然后再诱导其生成根。,由愈伤组织分化产生不定芽,5.移栽成活阶段,生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽室外以利生长。此时的小苗还十分幼嫩，移植应在能保证适度的光、温、湿条件下进行。在人工气候室中锻炼一段时间(称为炼苗)能大大提高幼苗的成活率。,第二节 植物细胞工程,一 植物组织培养二 植物细胞培养三 植物原生质体培养与融合四 人工种子的研制五 植物种质资源离体超低温保存六 植物细胞工程研究进展（综述）,二 植物细胞培养,（一）细胞悬浮培养（二）固定化细胞培养（三）植物细胞培养与有用物质生产,（一）细胞悬浮培养,1.概念：是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。怎样获得单个游离细胞?（酶解、振荡）怎样获得小细胞团？（愈伤组织分割；机械法；单细胞聚集）,2.基本过程：外植体（幼胚、胚轴、子叶等）培养基愈伤组织（松散性好、增殖快、再生能力强）或酶解物震荡培养大量植物细胞次生代谢产物 3.悬浮培养三个优点：改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面；避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；可以适当改善气体的交换。,4.一个成功悬浮细胞培养体系须满足的条件：悬浮培养物分散性良好：细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速：悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,植物愈伤组织的悬浮培养,5.植物悬浮培养系统：（1）封闭式培养系统组成、操作、有缺点（半连续培养和连续培养）实例（银杏、冬青、蔷薇等）,（2）机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的 基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；,优点：很高的 溶氧系数，适于耐剪切力强的植物细胞培养。缺点：剪切力大 实例：烟草细胞、水母雪莲细胞等,因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。,（3）气压搅拌式培养系统考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，固发展了气升式生物反应器；但其缺点是搅拌不均匀。,6.植物细胞悬浮培养的目的（或应用）：种质保存固体培养基上继代培养 得到大量植物细胞产物如人参干细胞粉；紫草细胞消炎药物 得到次生代谢产物液体培养(主要应用)生物转化用酶的作用将底物转化为所需的产物,（二）固定化细胞培养,1.固定化细胞：定义：指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。优点：稳定性好，产物易分离，利于连续化生产。缺点：只适合分泌到细胞外的次生代谢物的生产。细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低。采用固相培养，将细胞培养在惰性基质中，细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。,2.植物细胞固定化的方法,（1）吸附法:利用各种固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。吸附材料：多孔陶瓷、多孔塑料、多孔玻璃等；实例：多孔泡沫放入辣椒细胞的培养液中。（2）包埋法 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,3.固定化植物细胞的特点,（与植物细胞悬浮培养对比）（1）减轻剪切力和其它外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性（载体的保护作用）（2）细胞不易聚集成团（细胞被束缚在一定的范围）（3）更换培养液容易（4）缩短生产周期（可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产）。（5）固定化细胞易与培养液分离（6）细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。,（7）消除代谢产物积累对细胞生长的抑制作用培养周期：延迟期（细胞很少分裂或刚刚开始分裂），直线生长期（对数生长期，细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低，细胞数目迅速增长，生长速率保持不变，细胞数增长最快，而细胞的干重和蛋白质含量增长较慢），减缓期（细胞数目的增长速度减缓），静止期（细胞分裂停止，细胞数目恒定；培养基中营养耗尽，必须进行继代培养，进入静止期之前，细胞数增长减慢，而细胞鲜重和干重增长超过了细胞数的增长，并一直持续到静止期）,4.固定化植物细胞培养系统,平床培养系统,立柱培养系统,4.固定化植物细胞培养系统,4.固定化植物细胞培养系统,5.固定化植物细胞培养的应用,（三）植物细胞培养与有用物质生产,利用培养细胞生产有用物质（次生代谢物质）的原理细胞的全能性：培养细胞具有该物种的药物生物合成（次生代谢物质）的全能性。每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。植物次生代谢产物是指植物中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。,1.一般程序,（1）选材 培养器官、组织的选择：取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。细胞生长状态的选择：自然条件下，一般植物生长不活跃的部分，如老叶、果实和种子，倾向于积累次生代谢物，而分生组织等快速生长的部分，次生代谢物的含量低。植物离体培养下，一般脱分化的细胞生长旺盛，很难积累次生物质。当细胞接近于衰老时，才趋向于积累次生代谢物质。,（2）细胞株系建立 建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）合成能力高的细胞株系的筛选与更新：筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。对细胞培养的选择有两个基本要求：a.有用物质的合成积累能力强；b.生长速度快。（3）大量培养：将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。（4）产品提取与纯化：从植物细胞培养物中提取和纯化有的产品。,2.培养方法二步培养法,细胞生长与次生物质的产生对培养基与培养条件的要求不同，因而在细胞工厂化培养中采用二步培养方法，既使细胞生长快，又使次生物质代谢多。第一步，促进细胞分裂，解决生物量生产问题；第二步，促进次生代谢物合成，解决次生物质的积累问题。在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。（一部分细胞用于提取物质，另一部分用于继续培养，进行下一个细胞周期）。,3.提高有用物质产率的技术因素,（1）细胞株系生物合成能力 以特异的器官为材料 筛选生物合成能力强的细胞株Wayner等用柠檬叶、鸡眼藤的培养物，经过筛选细胞株系，其次生代谢物是该植物完整植株的10倍。Zenk从长春花的培养物中，筛选出高产细胞株系，其生产根碱和阿玛碱的总量，比亲本植物高1.5倍，是亲本植物根含量的5倍。,（2）培养基中添加前体 前体：有用次生代谢物的前驱物。烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。（前体物质的加入时间非常重要，应注意。）,（3）培养基中生长调节剂（激素）的作用植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加吲哚乙酸（IAA），能合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟碱合成受阻。,（4）培养条件的影响 光照、温度等影响次生代谢。在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花氰苷，并且低温条件下，生成量高。,4.细胞培养与有用物质的生产,（1）生物碱 苦参愈伤组织苦参碱降血压、扩张血管，治冠心病 乌头愈伤组织乌头碱驱寒、散风、通经、止痛 长春花愈伤组织长春花碱治白血病高效药 喜树叶愈伤组织喜树碱抗肿瘤 黄连愈伤组织小蘖碱（黄连素主要成分）抗菌消炎（2）醌类物质：利用紫草、决明等愈伤组织培养，生产具有抗细菌活性的醌类物质。,（4）蛋白质：商品胰岛素多数从动物的胰脏提取，价格昂贵。从苦瓜离体培养物种可提取胰岛素、SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶。（5）类黄酮类：银杏黄酮、花青素、查尔酮（6）甾体类：VD、激素、强心苷,（3）萜类物质：利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进入工厂化生产，如紫杉醇。,5.存在问题,植物细胞培养生产有用物质尽管有种种优点，但与微生物培养比还存在许多问题。生长速度较慢，通常完成一次生产周期需45周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。,植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比植物本身低，这主要是由于大多数离体培养细胞不能合成和积累所期望的化合物，当然也有些细胞株系产量高，这与微生物大不相同。生产技术上还存在一些问题。培养过程需要复杂的培养基及附加物，且易受细菌、真菌的污染；次生物的产量不甚稳定，成本较高等。,第二节 植物细胞工程,一 植物组织培养二 植物细胞培养三 植物原生质体培养与融合四 人工种子的研制五 植物种质资源离体超低温保存六 植物细胞工程研究进展（综述）,三 植物原生质体培养与融合,（一）概念：1.原生质体：植物细胞原生质体是指已经去除全部植物细胞壁的细胞。2.原生质体培养：是将植物原生质体在一定条件下培养，经过细胞壁再生而形成 细胞，再分裂成细胞团的过程。,3.原生质体制备：将旺盛生长的植物细胞，悬浮在含渗透压稳定剂的高渗缓冲液中，加入适量的细胞壁水解酶（真菌纤维素酶），在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏，除去细胞壁碎片、未作用的细胞等，即得。最初方法（Michel）：是用高速运转的刀具随机切割细胞，最终获得少量脱壁细胞供融合使用。,植物原生质体的特点（与植物细胞比）：仍然具细胞全能性：（学生总结）吸收能力增强分泌能力增强稳定性较差（学生总结）如何解决？,4.原生质体融合：用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。若取材为体细胞，则称为体细胞杂交。原生质体制备和培养是原生质体融合的先导技术。,设想中的“番茄-马铃薯”,原生质体制备原生质体融合杂细胞选择、培养与再生杂种或胞质杂种植株鉴定,（二）基本程序：,（1）取材与除菌：植物任何部位的外植体都可制备原生质体。多用活跃生长的器官和组织：因为由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。,1.原生质体制备,对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。较脏的外植体：先用肥皂水清洗再以清水洗23次，然后浸入70酒精消毒，再放进 3次氯酸钠处理，最后用无菌水漂洗，并以无菌滤纸吸干。,（2）酶解原因：细胞壁含纤维素、半纤维素、木质素以及果胶质等成分。酶：复合纤维素酶EA3-867、蜗牛酶、Onozuka R-10（含有纤维素酶、纤维素二糖酶以及果胶酶等。,反应液转绿是酶解成功的重要指标,（3）分离原因：反应液中除了大量原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。方法：200400目的不锈钢网或尼龙布过滤除渣、低速离心法、比重漂浮法。,（4）洗涤原因：刚分离得到的原生质体往往含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂。方法：以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤24次。,（5）鉴定：只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。已去除全部或大部分细胞壁，故呈圆形。在低渗溶液中，易胀破。荧光增白染色后置荧光显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。活力检测：借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察、光合作用测定、呼吸作用测定原生质体的活力。,2.原生质体融合,发展史：1973年Keller提出的高钙高pH法；1974年高国楠首创聚乙二醇法(PEG)诱导原生质体融合；1977年高国楠将聚PEG法与高钙高pH法结合；1978年Melchers用此法获得了番茄与马铃薯细胞融合杂种。1979年Senda发明了电激法。由于这一系列方法的提出和建立，促使原生质体融合实验蓬蓬勃勃开展起来。,（1）化学法诱导融合方法：无菌条件下按比例混合双亲原生质体滴加PEG溶液，摇匀、静置滴加高钙高pH溶液，摇匀、静置滴加原生质体培养液洗涤数次离心获得原生质体细胞团筛选、再生杂合细胞。,（1）化学法诱导融合,特点：PEG处理阶段，原生质体间发生凝集现象。加入高钙高pH溶液稀释后，紧挨着的原生质体间才出现大量的细胞融合，其融合率可达到1050。融合过程不受物种限制：同种细胞、异种细胞。有些融合是两个原生质体的融合，也有两个以上的原生质体聚合成团，但此类融合往往不大可能成功，融合子产生的异核率较高。,（1）化学法诱导融合,（1）化学法诱导融合,高浓度的PEG结合高钙高pH溶液对原生质体具有一定毒性，诱导融合时间要适中。处理时间过短，融合频率降低；处理时间过长，则将因原生质体活力明显下降而导致融合失败。Jelodar以丙酸钙取代氯化钙作助融合剂，融合频率和植板率都有明显提高，甚至超过了电激融合。,（1）化学法诱导融合,融合过程繁琐，但无需贵重仪器，试剂易得，是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇(PEG)结合高钙高pH诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。,2.原生质体融合,（2）物理法诱导融合1979年Senda等发明了微电极法诱导细胞融合。1981年Zimmermann等提出了改进的平行电极法。,（2）物理法诱导融合,方法：将双亲原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。,（2）物理法诱导融合,特点：a 电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和；b 而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，可获得较高的融合率。c 融合技术操作简便。,原生质体融合过程,3.杂细胞选择、培养与再生,（1）杂细胞的类型：亲本双方的细胞核、细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多；融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，丢失某个亲本染色体的现象就越严重。,（1）杂细胞的类型,融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量它方染色体或DNA片段构成；原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开，以后它们各自分裂生长成嵌合植株。,（2）杂种细胞选择,设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长，而任一亲本却不能在此条件下生长，或生长速度缓慢、或中途夭折。借助于精巧的显微操作技术将融合体和杂种细胞直接挑选出来进行单独培养 杂种细胞的选择系统 a 外观选择 互补选择 荧光标记选择 b 体细胞杂种的鉴定,（3）杂细胞培养与再生,双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养(液体或固体)，再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织再按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。,4.杂种或胞质杂种植株鉴定,（1）杂合细胞的显微镜鉴别根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大、小细胞融合的就是杂合细胞；若一方细胞基本无色，另一方为绿色，则白绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合细胞的标志。,发现上述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再生培养基培养。显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与生长。,（2）互补法筛选杂合细胞遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补生长互补抗性互补代谢互补,（3）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同工酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)和随机扩增多态性DNA(RAPD)分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。,（4）据融合处理后再生植株的形态特征进行鉴别从Cocking 取得制备植物原生质体的重大突破以来，科学家在植物细胞融合、植物细胞与动物细胞融合等方面进行了不懈的努力，已在种内、种间、属间乃至科间细胞融合后得到了200多例再生株。最突出的成就当推番茄与马铃薯的属间细胞融合。,已经获得的番茄-马铃薯杂交株，基本像马铃薯那样的蔓生，能开花，并长出 211cm的果实。成熟时果实黄色，具番茄气味，但高度不育。综上所述，虽然细胞融合研究至今尚面临种种难题和挑战，但该领域在理论及实践两方面的重大意义，仍然吸引了不少科学家为之忘我奋斗，更为激动人心的研究成果一定会不断涌现出来。,（三）细胞融合的意义,克服远缘杂交不亲和性，为广泛重组遗传物质开辟新途径(如野生种的有效利用等）可缩短育种年限 利用细胞融合技术转移细胞器（如叶绿体、线粒体等）及目的基因等。,第二节 植物细胞工程,一 植物组织培养二 植物细胞培养三 植物原生质体培养与融合四 人工种子的研制五 植物种质资源离体超低温保存六 植物细胞工程研究进展（综述）,四 人工种子的研制,（一）定义：亦称合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds），任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其它成分的人工胶囊。,（二）人工种子的构成及特点,1.构成：,（1）人工种皮：是包裹在人工种子最外层的胶质薄膜。该膜允许内外气体交换畅通，防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏，具备一定的机械抗压力。（2）人工胚乳：是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，以生成胚状体的培养基为主要成分，根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。（3）胚状体：是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构，并具有萌发长成植株的能力。,作为21世纪极具发展潜力和经济价值的高科技成果，具有以下突出的优点：可以不受环境因素制约，一年四季进行工厂化生产；由于胚状体是经人工无性繁育产生，因此有利于保存该种系的优良性状；与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利于胚状体的健康生长。,2.特点,虽然人工种子的研制历经二十几年已经取得了长足的进展，但是仍有一些关键技术尚未攻克。如：人工种皮的性能尚不尽人意；还未找到一种符合多数物种需要的人工胚乳；胚状体如何让它处于健康的休眠状态；人工种子怎样做到既延长其保存时间又不明显降低萌发率等。不过有理由相信，不久的将来，人类终将摆脱大自然的羁绊，实现工厂化生产植物种子的目标。,制备路线,（三）人工种子的制备,通过外植体的固体培养基培养，液体培养基的悬浮细胞培养以及花药、花粉的诱导培养都可获得数量可观的胚状体。但这些胚状体往往处于胚胎发育的不同时期，不符合大量制备人工种子的需要。因此诱导胚状体的同步化生长成了制备人工种子的核心问题。,1.胚状体的制备,2.胚状体的同步生长,（1）低温法：在细胞培养的早期对培养物进行适当低温处理若干小时。由于低温阻碍了微管蛋白的合成，纺锤体形成受阻，所以滞留于有丝分裂中期的细胞增多。此时再让培养物回复到正常温度，细胞则同步分裂。（2）抑制剂法：细胞培养初期加入DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶等，使细胞生长基本上都停顿于G1期。除去抑制剂后，细胞进入同步分裂阶段。,2.胚状体的同步生长,（3）分离法：在细胞悬浮培养的适当时期，用一定孔径的尼龙网或钢丝网或密度梯度离心法，收取处于胚胎发育某个阶段的胚细胞团，然后转移到无生长素的培养基上，使多数胚状体同步正常发育。（4）通气法：在细胞悬浮培养液中每天通人氮气或乙烯12次，每次几秒或更长时间，可显著提高有丝分裂同步率。,（5）渗透压法：随着植物胚状体的发育，其渗透压值呈现规律性的从高到低的变化。配制一定渗透压值的培养基而使胚状体的发育停留在指定的阶段(如向日葵球形胚的渗透压为17.5)，从而达到同步发育的目的。,2.胚状体的同步生长,2.胚状体的同步生长,控制细胞及胚状体的同步化生长是一个尚未完全解决的问题。除了上述提出 的外因干预以外，物种及不同外植体细胞的敏感性，对实现同步生长也有很大影响。只有经过实验摸索才可能成功。此外，刚收获的胚状体含水分很高，不够成熟，亦难以储存。一般应经自然干燥47天，使胚状体转为不透明状为宜。,3.人工胚乳的制备,人工胚乳的营养需求因种而异，但与细胞、组织培养的培养基大体相仿，配加一定量的天然大分子碳水化合物(淀粉、糖类)以减少营养物泄漏。常用人工胚乳有MS(或SH、White)培养基+马铃薯淀粉水解物(1.5)；0.5SH培养基+麦芽糖(1.5)等。可根据需要在上述培养基添加适量激素、抗生素、农药、除草剂等。,4.配制包埋剂及包埋,人工种子的制作过程中，包埋是非常重要的一个环节。理想的包埋介质应该满足以下条件：对所要包埋的胚乳无伤害。有足够的柔软性，可以保护胚乳、并允许其发育。有一定硬度，避免运输、操作过程中的伤害。有穿透性，传递细胞生长所需的营养；并能容纳其他附加成分，如防腐剂、杀虫剂等。可以用现有的温室或农机机械进行播种。,4.配制包埋剂及包埋,通过大量实验对比，人们选择了海藻酸盐作为人工种子的包埋剂。优点：成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性极低、成本低廉等。缺点：水溶性营养成分易流失、表面易结团等。,海藻酸钠法,4.配制包埋剂及包埋,上述方法获得的人工种子，其直径随滴管口径的大小而定；每颗种子内含胚状体数目主要取决于包埋剂中胚状体的密度；人工种皮的厚度则随人工种子在CaCl2溶液中离子交换时间的长短而定，一般掌握在10-15min。种皮太厚，不利于胚状体萌发；种皮太薄，则在贮存、运输以及播种过程中都会遇到麻烦。,4.配制包埋剂及包埋,人工种子的包埋方法主要有以下四种，可根据需要选择。复合凝聚：指两种带相反电荷的电解质在水中相互作用形成多聚体包被溶液。界面聚合：在两相界面处因溶解度低而成膜。离子交换凝胶：经过离子交换而形成结合物成为凝胶代表物质，如海藻酸盐包埋。变温凝胶：高温下为液体，低温下为固体凝胶，因此可用各种模具塑造不同形状的凝胶块。,5.人工种子的贮存与萌发,人工种子的贮存与萌发是尚未攻克的难关。一般要将人工种子保存在低温(47)和干燥(相对湿度小于67)条件下。将胡萝卜人工种子保存在上述条件下，两个月后的发芽率仍接近100。但这种贮存方式的费用是昂贵的。在自然条件下人工种子的贮存时间较短，萌发率较低。,5.人工种子的贮存与萌发,柯善强(1990)报道，在人工种皮中加入了防腐剂，黄连人工种子在未消毒土壤中的萌发率仍仅为4.45.2。桂耀林(1990)的刺五加人工种子的萌发率为1420，但在无菌土壤条件下则高达90以上。,综上所述，尽管人工种子的研制尚处于实验室研究阶段，但它那令人神往的产业化前景仍吸引着各国政府和科学家投入巨额资金，付出辛勤汗水，相信不久成功研制人工种子的美好时刻一定会到来。,马铃薯人工种子,第二节 植物细胞工程,一 植物组织培养二 植物细胞培养三 植物原生质体培养与融合四 人工种子的研制五 植物种质资源离体超低温保存六 植物细胞工程研究进展（综述）,五 植物种质资源离体超低温保存,（一）概 述（二）植物材料超低温冻存的细胞学基础（三）超低温保存的方法（四）影响超低温保存效果的主要因素（五）超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术,（一）概 述,1.植物种质资源低温保存意义（1）防止资源灭绝（2）节约人力物力（3）便于交流,种质资源低温保存（cryopreservation）由cryo和preservation组成，在英语中cryo被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。习惯上，人们将-80以下的低温称为超低温，干冰温度（-70）称为极低温，低温则从4 往下推（李广武等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5（沈德绪等，1986）。,2.超低温保存的概念,目前常用的超低温保存方法可分为两类，即冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存。在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。,3.超低温保存方法,（二）植物材料超低温冻存细胞学基础,1.细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60%90%。细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90%，很容易冻结。由于细胞内含有复杂的化合物，细胞内的溶液并不象纯水那样在0左右结冰。,理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5-15，细胞内游离水的冻结在-25。-30时，细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在-100温度下也不冻结。据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），细胞游离水的冻结温度（-30）可被认为是细胞冻存的安全温度，故细胞冻存的两步冻结法是以-30为基础的。控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术关键。,（二）植物材料超低温冻存细胞学基础,2.植物细胞超低温保存过程中的致死损伤细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；二是细胞在196下长期贮存；三是细胞解冻。,植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理基础之上。种质超低温保存成功的关键，在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此，针对不同种类的植物材料，筛选适合的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式，可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。,（三）超低温保存的方法,超低温保存植物种质资源的程序包括：培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。,（三）超低温保存的方法,1.传统的降温冰冻方法 快速冰冻法 慢速冰冻法 两步法 逐级冰冻法,（三）超低温保存的方法,2.玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。,（1）玻璃化法定义：是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保存终止后，复温时要快速化冻，防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成