植物细胞代谢产物制备I.ppt

第四篇 生物制品生产,第6讲 植物细胞代谢产物制备,2011年2月4日，美国癌症协会（ACS）发表了全球癌症统计学数据报告统计数据显示，2008年全球癌症新发病例约为1270万，癌症死亡例数为760万；其中发展中国家的癌症新发病例和死亡病例分别占到56%和64%。乳腺癌是女性最常见的癌症（23%），乳腺癌相关死亡率也居女性癌症死亡率之首（14%）。肺癌是男性最常见的癌症（17%），肺癌相关死亡率占到男性癌症死亡率的23%。,第9章内容安排：,植物细胞培养植物细胞生产次级代谢产物的应用举例分析与讨论植物组织培养及应用举例分析,本节主要内容：植物细胞培养技术本节关键问题：植物细胞培养的生物反应器：悬浮培养、固定化培养细胞培养的操作方式及各自特点：分批、流加、半连续、连续、灌注培养,一 植物细胞培养的定义,植物细胞培养（Plant cell culture）是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。,二 植物细胞特点,问题1：与微生物相比，植物细胞有什么特点？细菌，真菌、植物细胞都有细胞壁细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。细菌只有核糖体一种细胞器。植物细胞比微生物细胞大。,植物细胞直径一般约为10-200m，平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在于培养液中。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周。植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。,三 植物细胞培养历史,20世纪50年代，泰尔克（Talecke）和尼克尔（Nickell ll）证实植物细胞可生长在悬浮培养液中。随后，人们发现离体培养的植物细胞具有合成代谢产物的能力。1956年，尼克尔（Nickell）和卢荻（Routin）申请了第一个用植物细胞培养生产化学物质的专利。20世纪80年代后期，紫草宁等细胞培养生产次获得了产业化（紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药）。,四 植物细胞培养技术,（一）培养基植物细胞培养的培养基主要由碳源、氮源、无机盐、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。目前应用广泛的基础培养基有MS、B5、N6等无机盐：大量元素NSPKCaMg等、微量元素有机物：糖类、氨基酸、维生素等调节物质：激素与微生物培养基相比：需要大量无机盐；多种维生素和激素；一般采用无机氮源；一般以蔗糖为碳源。,（二）植物单细胞分离,植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞问题2：植物组织培养、细胞融合时单个植物细胞是如何获得的？1.酶解法选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质（纤维素、果胶、多糖）降解，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等。,2.愈伤组织法通过培养植物外植体诱导产生愈伤组织，并使其大量增殖，再通过机械震荡或者酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。,（三）植物细胞初步培养,看护培养（nursingculture）用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。这块愈伤组织被称为看护组织。由缪尔（M（Muir）于1953年创立。具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是：简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。,饲养层培养（Feeder layer culture）把处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。,（四）植物细胞大规模悬浮培养,细胞悬浮培养（Cell suspension culture）是将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态的培养方式。植物细胞悬浮培养主要在摇床和生物反应器中进行，培养方法与微生物类似。优点：1.可以增加细胞与培养液的接触，促进营养的吸收。2.保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果。3.可以达到较高的细胞浓度，容易放大培养,悬浮培养的生物反应器,一般所说的生物反应器是指细胞培养生物反应器，是为细胞生长提供合适的化学与物理环境并能检测控制细胞生长的装置。一般都有三部分组成：反应罐、控制系统、检测分析系统。,问题3：与传统微生物发酵罐相比，植物细胞培养的生物反应器有什么特点？由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，具有不同的生长特性，例如：较微生物细胞大，对氧的要求相对微生物要低，周期长，易团聚等。因此微生物反应器并不完全适合于植物细胞生长与生产，需要进行改造。例如：对剪切力耐受性差：搅拌桨改造需要光照：外光源、内光源，透明材料。易粘附：结构尽量简单。,机械搅拌式生物反应器（Stirred tank rioreactor）一般由罐体、搅拌桨、控温系统、气路、传感器等组成。依靠搅拌器使液体产生轴向流动和径向流动。该生物反应器的优点是搅拌充分，供氧能力和混合效果较好。,植物细胞培养时搅拌桨选择,搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。需要对搅拌罐进行改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。不同叶轮产生剪切力大小顺序为：涡轮状叶轮平叶轮折叶浆螺旋状叶轮,离心桨生物反应器采用三叶螺旋桨，同时采用微孔金属丝网作为空气分布器，能提供良好的混合状态，具有比机械搅拌桨底的剪切力。,气升式生物反应器(Air-liftbioreactor)由气升室、气降室、除气室和底部四部分组成。培养液循环的动力来自于气升室、气降室中因含气量不同而在底部产生的压力差，因而比鼓泡型有更均一的流动形式。根据反应器内部结构与气体分布器的位置不同可分为内环流和外环流两种。,鼓泡式生物反应器(Bubblecolumn bioreactor)又称为鼓泡塔式反应器，是最简单的气动式生物反应器。气体分布器一般位于底部中央，气体从底部通过喷嘴或孔盘进入反应器。它不含转动部分，整个系统密闭，易于无菌操作。不同于气升式生物反应器，液体在反应器内部呈无规律的湍流状态。培养过程中没有机械能消耗，适合于培养对剪切力敏感的细胞。然而对高密度及粘度较大的培养物，反应器的混合效率会降低。,其它类型生物反应器,转鼓式生物反应器(Rotating drum bioreactor)因为转子的转动带动培养罐转动，促进了气体交换与营养物质的吸收，具有悬浮系统均一、低剪切力、防止细胞粘附在壁上的优点，适合于高密度植物悬浮细胞的培养，已用于长春花、紫草的细胞悬浮培养。,（五）植物细胞固定化培养,问题4：植物细胞固定化培养有什么优点？细胞固定化培养（Cell immobilization culture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术。是在20世纪70年代的酶固定化催化技术基础上发展起来的。1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利用固定化的毛地黄、长春花细胞制备次级代谢产物。,与细胞悬浮培养相比，植物细胞固定化培养具有以下优点：1.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，维持了细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采用传统生物反应器大规模培养。2.悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传质。3.大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两个阶段。,4.细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。5.固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物的合成。6.固定化细胞可以反复使用，可以方便地进行产物的连续性收获，降低了成本。,1.固定化方法,吸附、交联、共价结合、包埋等。（1）吸附固定法通过物理吸附、离子吸附（依靠静电引力固着在带有异电荷的载体上）使细胞固定在载体上。（2）共价结合法细胞表面的基团（如氨基、巯基、咪唑基、酚羟基等）和固相支持物表面的基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。,（3）包埋法,A凝胶包埋问题5：与前面讲过的哪个内容相似？,微囊化（Microencapsulation）是利用天然的或者合成的高分子材料作为囊壁材料将细胞包裹成微米级的微小球囊，形成的微囊膜是亲水半透膜，培养基的营养成分以及代谢产物可以通过微囊膜进行交换。,海藻酸盐(Alginate)多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)微囊化,在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和阳离子之间形成离子键。因海藻酸钙不溶于水，从而在细胞表面形成凝胶。如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将 将Ca2+离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，不会再被螯合剂溶解。再用柠檬酸去除钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞悬浮在微囊内。,琼脂糖(Agarose)凝胶包埋将细胞悬浮于经过灭菌处理的琼脂糖中，不断搅拌，待混合物凝结后，将包埋有细胞的琼脂糖凝块挤进无菌的金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。这种方法虽然简单，但因制得的颗粒较大、形状不规则。,2.固定化细胞的活力测定,染色法例如：荧光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate,FDA）染料能被活细胞吸收，酶解脱去乙酰基而使这种染料产生荧光。死亡的细胞没有这种现象，因此可以判定固定化后的细胞是否具有活性。呼吸强度测定采用氧电极法测定细胞的呼吸作用来表示细胞的存活率。细胞生长和分解速率的测定细胞数量或重量的增加可以作为细胞活性的指标。由于植物细胞的聚集性特点，采用湿重或干重法比较方便实用。,3.固定化细胞培养的生物反应器,对于固定化的植物细胞可以：（1）采用合适的机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡式生物反应器等进行培养。（2）也可将细胞直接吸附或包埋在特殊设计的生物反应器内的介质表面或内部进行培养。,填充床生物反应器(Pipe-conebio-filter reactor)细胞固定在支持物的内部或表面，细胞固定不动，流体按照一定方向从反应器中流过实现混合和传质。可以是垂直的，也可以是水平的。一种垂直的填充床生物反应器示意图如图。优点是单位体积细胞的容量大。缺点是混合效率低、易造成传质困难、固定床颗粒或支持物碎片会阻塞液体的流动。,涓流床生物反应器(器(Trickle bed bioreactor)又称滴流床反应器，细胞固定在反应器内部，气体从下往上流动，而液体从上往下流动，由于流量小，只能在固定化细胞表面形成涓涓细流。与填充床生物反应器不同，固定化细胞并不被流体浸没，空隙被大量气流占据，因此适合好氧细胞生长。,（六）植物细胞培养操作方式,根据细胞培养时营养成分添加方式以及培养液与细胞的收集方式的不同，可以有：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种操作方式。,1.分批式培养（Batch culture）,是指细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养，在培养过程中培养液体积不变，不添加营养成分，待细胞增长和产物积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物和培养液的培养方法。问题6：分批培养过程中，细胞的生长一般分为那几个阶段？五个阶段：延迟期（1）、指数生长期（2）、减速期（3）、平台期（4）和衰退期（5）。,（1）延迟（适应）期（Lag phase）是细胞适应新环境的阶段。此时细胞很少分裂，营养物几乎不消耗。延迟（适应）期时间的长短与种龄、接种量大小及营养物质新旧环境差异大小有关。采用有活力的种子、适当提高接种量有利于缩短延迟（适应）期。（2）指数生长期(Exponential growth phase)该阶段，由于培养基中的营养物质比较充分，细胞生长不受限制，生长旺盛，细胞浓度随时呈指数增长。细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比,比生长速率达到最大并保持不变。细胞浓度增长一倍的时间称为倍增时间(d)。微生物细胞的倍增时间(d)较短：细菌一般为0.25-2h；哺乳动物细胞一般为15-200h，植物细胞倍增时间跨度大，草本类一般为1-3d，木本一般为2-10d。,典型的分批培养过程,特点：体积不变；营养逐渐消耗殆尽；细胞浓度增加后维持不变，逐渐死亡,（3）减缓期(Progressive decelerational phase)由于细胞浓度增高、营养物质消耗、有害代谢产物积累，细胞生长受到抑制，生长速率逐渐下降，细胞生长进入减速期。（4）平台期(Plateau phase)由于细胞浓度增高、营养物质大量消耗、有害代谢产物大量积累，细胞生长受到严重抑制，生长速率下降。生成的和死亡的细胞数量大致相当，细胞生长进入静止期，细胞浓度达到最大值。（5）衰退期(Senescence phase)由于营养耗尽，有害物质大量积累，细胞开始自溶、死亡。大多数分批培养都在进入衰亡期前结束。,2.流加式培养（Feeding culture）,是指在分批培养过程中，间歇地补加一种或多种营养成分的培养方法。细胞初始接种的培养液体积一般为终体积的1/21/3。整个培养过程没有培养液流出或细胞产品的收集。特点：体积增加；营养阶段性补充；指数期延长，细胞浓度增加,流加培养的优点,与分批式培养相比，具有以下优点：（1）可根据细胞生长速率、营养物消耗情况，保证合理、充足的营养。（2）可以减少产物反馈抑制，排除有害代谢产物积累带来的细胞损伤。细胞不易老化。（3）可以避免在分批培养中因一次投料过多造成的底物抑制等影响，改善培养液流体学性质。（4）可延长指数生长期，从而提高细胞浓度，延长细胞培养周期。产物浓度较高，同时又能实现连续收获。,3.半连续式培养（Semi-continuous culture）,又称为重复分批式培养或换液培养。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原有体积。特点：总体积不变；营养阶段性补充；阶段性收获细胞和培养液。每次稀释培养体积的1/2 3/4，以维持细胞的指数生长状态。,4.连续式培养（Continuous culture）,是在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养液以相同的速度连续从生物反应器流出。理论上讲，该过程可无限延续下去。特点：细胞能在近似恒定状态下生长，营养物质浓度、细胞浓度、产物浓度、pH值基本可保持恒定；稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期；体积不变。,5.灌流式培养（Perfusion culture）,是把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分培养液取出，同时又连续不断地补充新的培养液。特点：细胞浓度增加；总体积不变；营养基本维持恒定。它与连续式操作的不同之处在于取出培养液基时，细胞均保留在生物反应器内。,本节小结,回顾1：植物细胞与微生物相比有什么特点？回顾2：悬浮培养、固定化培养各有什么优缺点？回顾3：常见的植物细胞培养生物反应器有哪些？回顾4：细胞培养操作方式有哪些？各有什么特点？各有什么特点？,