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植物细胞全能性,徐晓洋2011201043,植物细胞全能性（totipotency）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。,1、植物细胞全能性的早期研究,2、植物细胞全能性理论的实验证据,5、展望,4、植物细胞全能性（组织培养）的应用,3、植物细胞全能性的调控机制,德国植物生理学家科戈特利布哈布兰特（Gotlieb Haberlandt，1854-1945）在1902年提出植物细胞全能性的理论，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。,1、植物细胞全能性的早期研究,Gotlieb Haberlandt,Plant Tissue Culture:100 years since Gottlieb Haberlandt,History of plant tissue culture,Molecular Biotechnology Volume 37,Number 2,169-180,DOI:10.1007/s12033-007-0031-3,戈特利布哈布兰特将分离的小野芝麻栅栏细胞、大花凤眼兰叶柄木质部髓细胞、疗肺草和荨麻腺毛细胞、紫鸭拓草雄蕊绒毛细胞等，培养在克诺普盐溶液添加葡萄糖和蛋白胨的培养基中，以诱导培养细胞的分裂和分化。虽然 这些培养细胞能合成淀粉，体积增大，存活几个星期，但没有细胞分裂发生。主要原 因是他所选择的实验材料和培养基不适合。在以后的研究中，培养基成分的研究成为组织培养研究或植物细胞全能性研究的一个突破口。,20世纪 30年代至50 年代期间，随着B族维生素的应用、生长素和细胞分裂素的发现，为完善培养基成分和进行植 物组织培养奠定了基础。,1957年斯科格和米勒(Skoog and Miller)提出植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中根和芽的分化取决于生长素与细胞分裂素的相对浓度，比例高时促进生根，比例低则促进芽的分化。1962年，穆拉希格和斯科格(Murashige and Skoog)提 出了适合于烟草组织培养的MS培养基，并成为现今应用最广的一种培养基。这些研究为用实验证实植物细胞的全能性 打下了坚实的基础。,2、植物细胞全能性理论的实验证据,要证实植物细胞的全能性，需要解决两个问题，一是离体单细胞增殖，二是从单细胞增殖的组织发育成完整植株。,第一个问题在发展细胞培养装置后得到解决，先后发展了四种培养方式：震荡培养，平板培养，悬浮培养和悬滴培养。,在细胞培养的基础上赖纳特和斯图尔德(Reinert和Steward,1958)报道了胡萝卜悬浮培养细胞和愈伤组织形 成体细胞胚，首次用实验科学地论证了植物细胞全能性。,胡萝卜(Reinert and Steward,1958),烟草(Vasi 1965),花药培养(Guha and Maheswari,1966),原生质体培养(Nagata and Takebe,1971),3、植物细胞全能性的调控机制,植物细胞全能性的证实推动了植物组织培养及其相关研究领域的迅猛发展。在茎尖和愈伤组织培养研究中，我 国已有 700种以上的植物能离体再生植株。尽管如此，植物细胞全能性的调控机制仍然不清楚，吸引人们从细胞学、分子生物学等方面进行研究。,3.1 细胞学研究,植物体细胞全能性的表达，需要诱导分化成熟的细胞脱分化成为分生组织细胞，再诱导分生组织或愈伤组织分化不定芽或体细胞胚胎，最后形成完整植株。,在研究胡萝卜培养细胞的体细胞胚发生过程中，发现有感受态细胞的存在。感受态细胞指外植体细胞在培养初期获得能被诱导形态发生的状态的细胞。,胡萝卜感受态细胞可以分成以下几类：B状态细胞，球形且液泡化、直径约为 12m的细胞；C状态细胞，球形且细胞质丰富、直径约为12m的细胞；D状态细胞，长形、液泡化的细胞。,B状态细胞的细胞壁存在阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP），而 C状态细胞不含AGP。麦克凯布（McCabe，1997）等，利用能够识别上糖类抗原簇的单克隆抗体JIM8，进行细胞免疫荧光标记，揭示了胡萝卜感受态细胞发生和生长发育的过程。,B状态细胞细胞壁能被 JIM8抗体标记(深灰色)，B状态细胞细胞壁出现极性时，只有一半细胞壁能被JIM8抗体标记，并开始进行细胞分裂，形成不能被JIM8标记的C状态细胞和完全被 JIM8标记的F状态细胞。C状态细胞是胚胎感受态细胞，与来自B状态细胞的信号分子反应后形成胚胎决定细胞，并继续发育成体细胞胚。F状态细胞逐渐萎缩，成为 G状态细胞，最后细胞死亡。（McCabe，1997）,3.2 分子生物学研究,分子生物学研究发现，从成熟细胞脱分化开始，一些基因的表达就与形态发生或细胞全能性表达有关。,在与体细胞胚发生有关的许多蛋白质和基因克隆研究中，发现对植物细胞获得胚性感受 态起作用的基因是体细胞胚胎发生的受体激酶基因（somatic embryogenesis receptor kinase,SERK），该基因表达被认为是胚性细胞的标记。,l997年，Schmidt 等在胡萝下胚轴胚性细胞培养物中分离出的一段 cDNA克隆编码一种 LRRRLK，由于它首先在体胚发生过程的胚性单细胞中表达，因此命名为体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶(somatic embryogenesis receptor kinase,SERK)基因。,SERK 基因家族：,DcSERK AtSERK1-AtSERK5 ZmSERK1-ZmSERK3 OsSERK1 OsSERK2 GhSERK1-GhSERK3 TcSERKMtSERK1 MtSERK21,SERK 基因结构,DcSERK首先在培养了7 d的胚性培养物中表达。下胚轴培养5 d 时，增大的细胞开始出现，7 d时增生细胞团表面的一些起源于原维管组织的增大细胞开始表达 SERK。随后的培养过程中，一些小型细胞簇也表达SERK，这些细胞都发育成体胚。原位杂交结果表明，SERK表达在时间与数量上都与“感受态细胞”的出现紧密相关。RT-PCR后Southern杂交也表明，SERK 表达和外植体感受态细胞开始出现之间存在密切的相关，认为 SERK是感受态细胞的一种标记。,A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos,Development 124,2049-2062(1997),Ed D.L.Schmidt,Flavia Guzzo,Marcel A.J.Toonen and Sacco C.de Vries,在拟南芥等其他植物中，SERK不仅在胚性细胞中表达，在某些非胚性细胞中也有表达。AtSERK1 的表达比较广泛，不仅在早期的合子胚及培养的胚性细胞内大量表达，还在雌配子体、孢子体原基周围细胞层、表皮细胞及成熟的根茎叶维管组织中少量表达，在合子胚发育中只表达到心形期。,TcSERK与ZmSERK2、MtSERK1 的表达方式相似，在合子胚和体细胞胚的整个发育过程中均表达。TcSERK不仅在胚性愈伤和增生胚中大量表达，还在叶片中有微量表达,但在根、花瓣及退化雄蕊中没有表达信号。,SERK 基因的表达调控,不同植物的SERK基因有特定的表达方式，部分SERK基因在体细胞胚发生过程中是过渡性表达的，暗示SERK基因的表达可能受到严格调控。,Kim等对苜蓿进行高胚性和低胚性细胞培养，发现培养基内添加细胞分裂素类似物BAP(6-benzylaminopurine)和生长素类似物NAA(1-naphthaleneacetic acid)的培养物MtSERK1 的表达水平在 2 天内可显著地提高，且这种诱导作用至少持续了 5 周。而培养基内不添加任何植物生长物质的培养物MtSERK1 的表达水平在 2天后迅速降低，表明植物生长物质BAP和NAA可能参与了MtSERK1 表达的诱导或维持。,以上研究结果表明植物生长物质参与了SERK基因的表达调控，且在不同植物中可能存在不同的调控机制。,在SERK基因表达的负式调控机制中，拟南芥AtSERK1研究得最清楚。AMP1蛋白很可能对AtSERK1的表达起负式调控作用，因为amp1 突变体比AtSERK1过量表达更能提高体细胞胚发生率；amp1 突变体的AtSERK1 表达水平远远高于野生型；胚状体萌芽后，AMP1 蛋白的逐步积累与AtSERK1 表达降低或消失又相一致。,AMP1 蛋白是谷氨酸羧肽酶，有清除小分子和小信号肽分子的功能，而AtSERK1 蛋白的N端恰恰具有信号肽的特征，这可能是AMP1 蛋白负式调控AtSERK1 表达的分子机理。,SERK 基因可能的其他功能：,SERK 参与孢子体发育：拟南芥serk1 或serk2 的单突变体不能引起孢子体发育的任何异常表型，但serk1serk2 双突变体导致孢子体发育不完全或雄性不育。serk1serk2 双突变体的造孢细胞产生小孢子母细胞只能进行减数分裂到四分体时期，随后母性细胞消失，导致雄性完全不育。,SERK 参与植物病害防御：OsSERK1 属于LRR-RLKs之一，不仅能被稻瘟菌侵染诱导表达，还参与了水稻抗稻瘟菌的反应。水稻受稻瘟菌侵染后，OsSERK1 被诱导表达，且它的表达量与水稻的抗病性有定性关系。,SERK 可能和植物非减数分裂的孤雌生殖有关：,SERK and APOSTART.Candidate Genes for Apomixis in Poa pratensis,Plant Physiology,August 2005,SERK 的信号传导,SERK蛋白具有典型的胞外受体结合域、跨膜结构域和胞内激酶活性结构域等特征，能独立地完成信号的接收、跨膜转导和胞内传递。,目前，SERK参与的信号传导途径研究得最多的是AtSERK3（即BAK1）参与的芸苔素(brassinosteroid,BR)信号传导途径。,AtSERK3 与BR11 共同接收胞外BR信号，形成同源/异源二聚体或多聚体，抑制BIN2、GSK3 的活性或激活BSU1，改变胞内磷酸化水平及核转录因子BZS1和BZR1 的稳定性，促进BR调节基因表达，产生BR生理效应。,SERK 基因小结：,基因结构：,表达特征：,表达调控：,可能功能：,信号转导：,LRRRLK,受到植物生长物质参BAP和NAA以及AMP1蛋白的调控,参与体细胞胚发生，孢子体发育，植物病害防御和孤雌生殖等,DcSERK仅在胚性细胞中表达，其他SERK在非胚性细胞中也有表达,AtSERK3参与的芸苔素信号传导途径,4、植物细胞全能性（组织培养）的应用,4.1 无性系的快速繁殖,快速繁殖是组织培养在生产上应用最广泛、最成功的一个领域。通常一年内可以繁殖数以万计的种苗，特别对于名贵品种、稀优种质、优良单株或新育成品种的繁殖推广具有重要的意义。离体繁殖良种种苗最早在兰花工业上获得成功。兰花成熟的种子中大多数胚不能成活，种子不能发芽，但通过原球茎组织培养，能使兰花的繁殖系数大为提高，从而形成了20世纪60年代风靡全球的“兰花工业”。其他如牡丹、香石竹和菊花等难以扦插的名贵品种以及无籽西瓜、草莓、猕猴桃、葡萄、菠萝、柑橘、樱桃、杉木等的无性系快速繁殖都取得了进展，有力地推动了生产。,4.2 培育无病毒种苗,感病植株的不同部位病毒分布不一致，新生组织及器官病毒含量很低，生长点几乎不含病毒。这是由于分生组织的细胞生长快，病毒繁殖的速度相对较慢；而且病毒要靠筛管或胞间连丝传播，在分生组织中的扩散也受到一定的限制。茎尖越小，去病毒机会越大，但分离技术难度大，也较难成活。一般以0.20.5mm、带12个叶原基的茎尖为外植体，可获得无病毒株系。病毒病常使马铃薯减产50%左右。近年，中国马铃薯的无病毒种苗栽培面积已超过25万hm2，约占全国马铃薯栽培面积的1/10，目前仍在继续扩大之中。另外，在香蕉、苹果、甘蔗、葡萄、桉树、毛白杨、草莓、甜瓜、花卉上均通过试管脱毒，建立了试管苗工厂及无病苗圃。,4.3 新品种的选育,1.花培和单倍体育种,花药和花粉培育的主要目的是诱导花粉发育形成单倍体植株，以便快速地获得纯系，缩短育种周期、且有利于隐性突变体筛选，提高选择效率。中国科学院遗传研究所于1970年获得第一批水稻花药培养形成的幼苗，1971年又获得小麦花药培养的单倍体植株。近年来已有烟草、水稻、小麦、大麦、玉米和甜椒等一大批花培优良新品种在生产上大面积推广。,花药培养,这是用于克服远缘杂交不亲和的一种有效方法。例如，棉花远缘杂交杂种胚胎发育过程中，胚乳生长不正常，致使幼胚分化停止，如将杂交授粉后25d的胚珠进行离体培养，可使胚发育成杂种植株。至今，用胚培养技术已得到许多栽培种与野生种的种间杂种，并选育出一批高抗病、抗虫、抗旱、耐盐、优质品系或中间材料，从而扩充了作物的基因库。,2.离体胚培养和杂种植株获得,3.体细胞诱变和突变体筛选,在离体培养条件下，细胞不受整体的调控直接与环境接触，而且培养基中的化学成份和植物激素，又可能含有诱变因素或促进突变的条件，因此植物体细胞在离体培养条件下容易发生染色体畸变与基因突变。如果再加上物理或化学诱变处理，则诱发突变的机率更高。目前，筛选出的突变品系已在十几种作物的改良中得到了应用。如早熟、丰产的水稻和小麦新品系；高产多穗的玉米新品系以及抗白叶枯病的水稻；抗赤霉病或根腐病的小麦；高赖氨酸含量的玉米和大麦；抗早疫病的番茄；耐枯黄萎病、耐高温、耐盐的棉花新品系；抗晚疫病、枯萎病的马铃薯突变系以及抗除草剂的烟草品系等等。,4.细胞融合和杂种植株的获得,细胞融合(cell fusion)是指在一定的条件下，将2个或多个细胞融合为一个细胞的过程。用纤维素酶、半纤维素酶和离析酶等离析细胞以获得纯净的原生质体。原生质体脱掉了细胞壁后，易于诱导融合，也易于摄取外源遗传物质、细胞器等。通过原生质体融合可以部分克服远缘杂交中的不亲和性，提供新的核质组合，创造新的细胞杂种，为进一步选种育种扩展新的资源。目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。,4.4 人工种子,人工种子(artificial seeds)又称人造种子或超级种子，是指将植物组织培养产生的胚状体、芽体及小鳞茎等包裹在含有养分的胶囊内，具有种子的功能并可直接播种于大田的颗粒。人工种子通常由培养物、人工胚乳和人工种皮三部分组成。人工种皮常采用海藻酸钠、聚氯乙烯、明胶、树胶等。,制作人工种子首先要培养大批同步生长的、高质量的胚状体、芽体(不定芽、腋芽、顶芽)等培养物。现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功。,4.5 药用植物和次生物质的工业化生产,植物是许多有用化合物的重要来源，有些尚供不应求。目前植物细胞的大量培养主要用来生产药物和次生代谢物质，如抗癌药物、生物碱、调味品、香料、色素等。运用组织培养生产化学物质可以不受地区、季节与气侯等限制，便于进行代谢调控和工厂化生产，生产速度也比植物正常生长的速度快。例如日本大量培养人参细胞，并从中取得人参皂甙等有效成分，德国培养洋地黄取得疗效高、毒性低的强心甙，中国正在进行人参、三七、贝母、紫草、紫杉等药用植物的细胞培养，其发展前景十分诱人。,组织培养的应用,1.无性系的快速繁殖,2.培育无病毒种苗,3.新品种的选育,4.人工种子,5.药用植物和次生物质的工业化生产,5、展望,虽然许多植物包括重要的农作物，通过原质体培养、单细胞培养、花药或花粉培养和茎尖等组织器官培养能再生植株，但是正如英国诺丁汉大学Cocking教授所说的那样，当前植物组织培养还是属于经验性的工作，植物组织培养在无性繁殖、植物育种和植物遗传操作中的应用越 来越 多地取决于了解各种相互作用因素的作用机理。植物细胞的全能性表达，即培养细胞和组织的形态分化受到许多内外界因素的影响，如外植体的种类与生 长 发育状态、培养基成分，特别是植物生长调节剂、光照与温度等都影响培养物的形态发生。进一步揭示植物细胞脱分化和再分化过程中影响植物细胞全能性表达的信号传导和作用分子，有利于促进植物组织培养的发展和应用。,谢谢！,