植物组织培养第一章实验室的设计于基本操作.ppt

陈传红 制作 2007/5,第一章 实验室设计与基本操作,陈传红 制作 2007/5,本章内容提要：一、实验室及其基本设备 二、基本操作 三、培养基及其配制四、培养条件的控制,陈传红 制作 2007/5,一、实验室及基本设备 植物组织培养实验室一般可划分为四部分：化学实验室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯化移植室。,陈传红 制作 2007/5,1、化学实验室（准备室）,为培制培养基的重要场所，一般宜大不宜小，有较大的平面实验台；主要设备：精密天平（1/10000、1/100）、托盘天平、pH计、电冰箱、干燥箱、蒸馏水器、高压消毒锅、电炉和不锈钢锅等；玻璃仪器：试管、烧杯、量筒、容量瓶、移液管、滴管培养基分装器皿等；清洗器具：洗涤液、各式洗瓶刷、塑料框等。,陈传红 制作 2007/5,培养 容器,陈传红 制作 2007/5,立式高压蒸汽灭菌锅,卧式高压蒸汽灭菌锅,陈传红 制作 2007/5,pH计,陈传红 制作 2007/5,2、无菌操作室（接种室）,实验室的无菌条件组织培养成败的关键。是无菌操作的重要场所，面积宜小不宜大；墙壁光滑平整，地面平坦无缝，室外有缓冲室，放置工作服、拖鞋和帽子，并用紫外线随时灭菌，以减少杂菌进入无菌室；主要设备：接种解剖器械（各种剪刀、各种镊子、解剖刀）、空调、紫外线灯、超净工作台或接种箱等。,陈传红 制作 2007/5,超静工作台,陈传红 制作 2007/5,接种 推车,电热式 灭菌仪,接种操作,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,3、培养室,培养的重要场所，尽量安排在楼层较高处，以利采光，减少尘埃和杂菌污染；利于清洁、干燥和保温隔热；尽量利用自然光照，最大限度地加大采光面积；主要设备：培养架与灯光、配电板、石英电力时控器、空调机、加湿器、控温仪、温度湿度计、最高最低温度计等。,陈传红 制作 2007/5,培养架,试管苗培养,陈传红 制作 2007/5,培养室,陈传红 制作 2007/5,牡丹山茶在增殖,蝴蝶兰试管苗开花情况,金花茶滤纸桥液体 培养生根,非洲紫罗兰壮苗生根,陈传红 制作 2007/5,各种材料的培养,陈传红 制作 2007/5,4、鉴定室(细胞学观察室),是观察和鉴定培养物的诱导、分化、遗传物质转移的场所。主要设备：高倍显微镜、倒置显微镜、实体显微镜、恒温箱、以及做植物切片全套设备等。,陈传红 制作 2007/5,5、驯化移植室（温室、大棚等）,主要用于试管苗的移栽管理，以及实验材料的准备。主要设备：温室、大棚、荫棚、移植床、钵、盆、各种基质、喷灌设施等。,陈传红 制作 2007/5,移栽苗床,陈传红 制作 2007/5,二、基本操作,1.洗涤2.灭菌 植物组织培养中最致命的危害是污染，因此，灭菌工作是极其重要的。有菌的范畴：凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应以有菌物休看待。无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，或经其它物理的或化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。,陈传红 制作 2007/5,3、常用的灭菌方法物理方法：干热（烘烤和灼烧）、湿热（蒸煮或加压蒸煮）、射线处理、超声超、微波处理、过滤后的流体（空气、溶液）、离心沉淀、清洗和大量无菌水冲洗技术措施。化学方法：灭菌剂-升汞、福尔马林、双氧水、来苏尔、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钾、抗菌剂、洒精等。要根据工作中的不同材料和不同目的适当选用。,陈传红 制作 2007/5,（1）培养基的灭菌,培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器的体积（ml）最少时间(121、min）2050 15 75150 20 250500 25 1000 30 1500 35 200040,陈传红 制作 2007/5,(2)不耐热的物质将采用过滤灭菌,一些生长因子，如：生长素（IAA）、赤霉素（GA3）、玉米素（ZT）、脱落酸（ABA）、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理。通常采用过滤灭菌的方法。防细菌滤膜其孔径尺寸小于或等于0.45微米。,陈传红 制作 2007/5,无菌过滤器,陈传红 制作 2007/5,（3）干热灭菌法,玻璃器皿及耐热用具等，可采用干热灭菌。是利用烘箱加热到150，40min，或120，120min，来杀灭微生物。由于这一方法能源消耗大，费时间，这一方法并不常用，尽量用高压灭菌来取代它。,陈传红 制作 2007/5,（4）灼烧灭菌,无菌操作的器械主要有解剖刀、镊子、剪刀等；先将它们放入95的洒精中，用前取出在洒精灯上灼烧灭菌，后放于灭过菌的支架上，凉后立即用；通常刀和镊子等都是两把轮流用；一般使用70洒精的，但在实践中我认为使用95比70的效果要好。此外瓶口、棉塞、包口纸也常用此法灭菌。,陈传红 制作 2007/5,（5）布制品采用高压灭菌,布制品：如布（线）手套、帽子、套袖、工作服、口罩等。方法：洗净、凉干，用牛皮纸包好，放入高压锅中灭菌即可。,陈传红 制作 2007/5,（6）植物材料的表面灭菌,外植体（explant）：用作组织培养的材料，即在原生长部位取得并转移到人工培养基上生长的组织切段；简单地讲就是接种的植物材料。外植体的选择原则：优良的种质；健壮的植株；外植体大小；外植体的时期；细胞培养材料。接种（inoculate）：把处理过的材料经无菌操作手续放置到培养基上的过程。,陈传红 制作 2007/5,外植体表面灭菌过程,为了得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒。消毒试剂的选择及处理时间要依材料对试剂的敏感性而定。可用酒精棉对组织进行表面消毒。选材 刷洗、冲洗 用洗衣粉水或肥皂水浸洗（搅动）自来水冲洗 70酒精浸泡3060秒振荡 0.1升汞310分钟 无菌水冲先35次 接种,陈传红 制作 2007/5,常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较表,灭菌剂 使用浓度 持续时间 去除的难易 效果（）（min）次氯酸钙 910 5 30 易 很好次氯酸钠 2.530 5 20 易 很好过氧化氢 1012 5 15 最易 好溴 水 12 2 10 易 很好硝酸银 12 5 30 较难 好 氯化汞 0.11 2 15 较难 最好抗菌素 450ppm 3060 中 比较好,陈传红 制作 2007/5,三、培养基及其配制,1、培养基的种类及其组成培养基（Medium）：植物组织培养离体材料赖以生存的“土壤”，是外植体生长的营养物质。培养基种类：基本培养基、完全培养基。基本培养基组分：大量元素、微量元素，维生素和氨基酸，糖和水。,陈传红 制作 2007/5,基本培养基最常用的有十几种，如：MS，改良MS，White，改良White，Nitsch，MT，N6，B5，NT，Blaydes等。完全培养基：在基本培养基上根据不同要求附加一些植物生长调节物质以及其它的一些有机附加产物。根据物理性质分为：固体和液体培养基，固体培养基是在液体培养基基础上添加有凝固剂所致的。,陈传红 制作 2007/5,2、培养基四种母液（1）大量元素：其浓度大于0.5m mol/L的植物必须需元素。他们占植物体干重的百分之几十至万分之几。如：氧、碳、氢、氮、钾、磷、镁、硫、钙。（2）微量元素：其浓度小于0.5m mol/L的植物所需的元素。如：硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁、氯等。（3）铁盐：用FeSO47H2O与EDTA（乙二胺四乙酸二钠）配成的鳌合铁。,陈传红 制作 2007/5,（4）有机成分 维生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、烟酸（VB3）、泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc）、抗坏血酸（VC）等等，用量一般为0.11.0mg/l。是以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷酰氨、门冬氨酸、门冬酰氨、丙氨酸等。常用水解酪蛋白和水解乳蛋白，它们是含有约20种氨基酸的混合物，用量在101000mg/l之间。,陈传红 制作 2007/5,肌醇（环已六醇）：它在糖的互相转化中起作用。在适当的情况下使用，能促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成。用量为50100mg/l。腺嘌呤及其硫酸盐：可促进芽的形成和生长，难出芽的植物可试用。其它附加产物：椰乳、香蕉、麦芽提取物、酵母提取物、马铃薯块等，它们对培养的某些植物的器官、组织或细胞有一定的促进生长的效应。,陈传红 制作 2007/5,（5）其他糖：糖作为碳源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，还用于维持一定的渗透势。常用的碳源：蔗糖，葡萄糖和果糖也较常用。糖的用量一般为25。琼脂：在固体培养时琼脂是作为固化剂。用量一般在 610 g/L 之间。,陈传红 制作 2007/5,生长素类主要生理作用：促进细胞伸长生长和细胞分裂；诱导受伤组织形成愈伤组织；促进生根;促进植物性别分化，使形成的雌花雌株较多;防止落花、落果;促进无籽果实的形成等等。,（6）植物生长调节物质,陈传红 制作 2007/5,生长素类在组织培养中的作用 诱导愈伤组织；诱导根形成；与细胞分裂素配合使用，诱导不定芽的分 化，侧芽的萌动与生长，以及胚状体的形成等。,陈传红 制作 2007/5,常用的种类有：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4二氯苯氧乙酸（2,4-D）等。活性比较：2，4DIBA和NAA IAA。相同浓度下，以IAA的相对活性为1，则NAA为34，2，4D则为1020。2，4D的副作用较大，使用的浓度较窄，浓度高有毒害作用，同时有抑制芽的形成作用。一般在诱导愈伤组织时使用，而诱导分化阶段则只使用NAA和IBA。,陈传红 制作 2007/5,细胞分裂素类主要生理作用：促进细胞分裂与扩大，可使茎增粗，而抑制茎伸长；诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长，当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时，诱导芽的分化，这时细胞分裂素起着主导作用；抑制衰老，可延缓衰老过程，有保鲜产效果。,陈传红 制作 2007/5,常用的细胞分裂素有：苄基腺嘌呤（BA或BAP）异戊烯基腺嘌呤（2-ip）糠基腺嘌呤（KT）玉米素（ZT）,陈传红 制作 2007/5,赤霉素类主要生理作用：诱导茎的细胞伸长，对根则无效，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，植物组织培养中常用来促进幼苗茎的伸长生长；对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用，IAA/GA比值 高有利于木质部分化，比值低有利于韧皮部分化；代替低温和长日照，使一些两年生植物在当年就开花，可加快育种进程；打破种子、块茎、鳞茎等休眠，使之提前萌发。对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。,陈传红 制作 2007/5,活性炭：可防止组织自身的酚类物质排泌（酚污染)、变褐，对形态发生和器官形成有良好效应。减少培养基的透光性，有利于根的形成发育。具有强大的吸附能力，主要吸附非极性物质和色素等大分子，减少一些有害物质的影响，但是吸附的选择性很差，温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.51.0g/l。,（9）其它成分,陈传红 制作 2007/5,抗生素主要作用：防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。抗生素各有各有其抑菌谱，可单独用，也可混用。常用的抗菌素有：青霉素、链霉素、土霉素、庆大霉素、金霉素等。用量在520mg/l之间。注意！抗生素只能抑制菌的生长，而不能杀死各种细菌和霉菌。,陈传红 制作 2007/5,防止褐变的添加剂褐变：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色的现象。酚类代谢是合成木质素、芳香族氨基酸等化合物的中间途径。是产生一些天然的生长抑制物如香豆素、儿茶酸、绿原酸等的过程，这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。,陈传红 制作 2007/5,抗酚类氧化药剂半胱氨酸及其盐酸盐可用50200mg/l的浓度洗涤伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其它有：抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、二乙基二硫氨基甲酸酯等。褐变的影响因素：基因型、材料的生理状态、培养基成分、培养时间过长。防止褐变的其它方法：选择适当的外植体和培养条件、连续转移、加入活性炭、减少光照等。,陈传红 制作 2007/5,（8）pH值培养基pH值影响离子的溶解度，会使一些溶解度变小的盐类沉淀，影响到植物对各元素的吸收比例，产生缺素症状。pH一般调整到5.66.0范围内，可用1N的HCl和NaOH调整。pH值过高，会使得培养基脆而易碎；pH值过低，灭菌后培养基不能凝固。,陈传红 制作 2007/5,常用培养基成分表及母液浓度和用量,常用培养基的配方（见课本附录）,陈传红 制作 2007/5,常用培养基的特点,（1）高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER等培养基。它们应用最广泛，其特点是钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高，微量元素种类齐全。,陈传红 制作 2007/5,（2）硝酸钾含量较高的培养基如：B5、N6(朱至清等 1975)、LH、GS等培养基。B5培养基：除含有较高的钾盐外，还含较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素，较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养；N6培养基：适用单子叶植物花药培养，柑桔花药培养也适合，在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好；LH培养基：是矿盐浓度较高的一种培养基，其中铵与磷酸是同磷酸二氢铵提供的。,陈传红 制作 2007/5,（3）中等无机盐含量的培养基如：H培养基（Bourgingn 与Nitsch 1967）、尼奇培养基（Nitsch 1969）、米勒培养基（Miller 1963）。H培养基：其大量元素约为MS培养基的一半，仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低，微量元素种类减少，而含量较MS为高，维生素种类比MS多，适于花药培养；尼奇培养基：与H培养基成分基本相同，仅生物素比H培养基高10倍。与适合花药培养；米勒培养基：适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。,陈传红 制作 2007/5,（4）低无机盐培养基主要用于生根培养。如：改良White培养基（White 1963）、WS培养基(Wolter&Skoog 1966)、克诺普培养基(Knop 1965)、贝尔什劳特液(Berthelot 1934)、HB培养基(Holley&Baker 1963)等。HB培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好。,陈传红 制作 2007/5,4、培养基的制备,（1）母液的配制和保存注意事项：一般配成所需浓度的10100倍；各种药品要充分溶解后才能混合；混合时其稀释度要大，慢慢混合，边混合边搅拌；混合时注意先后次序，把含钙离子的化合物要最后混合；称量时规范操作；配好的母液要标明名称、倍数、日期等；母液一般放在24冰箱中保存。,陈传红 制作 2007/5,（2）培养基的配制程序水药品 混合 加入生长调节剂 pH调整糖琼脂 加热溶解 玻璃器皿 清洗 干燥 分装 接种 冷却凝固 高压蒸汽灭菌 封口,陈传红 制作 2007/5,（3）pH的调整pH值，一会影响到对离子的吸收；二会影响培养基的凝固；故培养基配制好后，调整pH值就十分重要。一般用1N的NaOH与1N的HCl来调整。培养基经高温高压灭菌后，其pH值会下降0.10.2。（4）培养基的分装和灭菌,陈传红 制作 2007/5,四、培养条件的控制,离体培养的优点：在人工控制的环境条件下，研究培养物的生长发育等生命活动。包括：光照、湿度、温度、气体等条件的调控。区别于大田栽培及温室栽培的不同特点。把专门研究离体培养的环境条件控制的研究内容称为离体生态学（In vitro Ecology）。,陈传红 制作 2007/5,1、光照,对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。光照参数：光照强度、光照时间和光波长短。普通培养室要求每日光照时间为1216h；光照强度约10005000lx；波长一般为普通日光灯的波长。培养物不同，对光照的要求也不同。,陈传红 制作 2007/5,对愈伤组织的诱导，黑暗条件有利于其生长；百合在黑暗条件下，长出小鳞茎，在光照条件下，长出叶片。器官的分化需要有光照，不同光波对器官分化有密切关系，如烟草愈伤组织的分化，蓝光区起主要作用；壮苗培养要加强光照，有利于试管苗的移栽成活。,陈传红 制作 2007/5,2、温度,温度对培养物生长作用更为明显，低于15或高于35对培养物生长都不利。一般培养室内的温度控制在252。不同植物有着最适的生长温度，满足其特定的温度要求，便可以获得最佳效应。如食用仙人掌的培养温度，在35 时，生长速度最快。,陈传红 制作 2007/5,3、湿度,湿度：培养瓶内的湿度，而培养瓶内的相对湿度常常达到100%。培养室的湿度一般为7080%。培养物周围的相对湿度影响着器官发生的类型。培养室相对湿度会影响到培养基的干涸，影响培养基的渗透压，导致影响培养物的诱导、脱分化与再分化，影响培养基的使用时间；培养室湿度过大，会造成细菌和霉菌滋生，易导致污染的产生。,陈传红 制作 2007/5,4、渗透压,培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常12个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而56个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。,陈传红 制作 2007/5,5、pH值,不同的植物对最适pH值的要求有不同，多在5 6.5左右，一般培养基皆要求5.8。pH值高于65时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值(约0.20.3)，故在配制时常提高pH值0203个单位。pH值大小调整可用01M的NaOH和0IM的HCI来调整，调节时一定要充分搅拌均匀。,陈传红 制作 2007/5,6、气体,在离体培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，通过振荡和搅拌来解决通气，就是液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等。同时要考虑容器的类型、培养基的量等。,陈传红 制作 2007/5,作业与 探究1、试简述植物组织培养实验室的基本组成与主要设备。2、论述培养基的组成。3、如何配制基本培养基及其注意事项。4、组织培养中培养条件有哪些？,