植物组织培养技术课件.ppt

,1,植物组织培养技术The Technology of Plant Tissue Culture,西南大学 生命科学学院 汤绍虎2011.11,2,主讲内容：一、植物组织培养的概念及分类 二、植物组织培养的生理依据 三、植物组织培养的应用 四、植物组织培养的操作技术 五、试管苗移栽,返回,3,一、植物组织培养的概念及分类,（一）植物组织培养的概念植物组织培养（plant tissue culture）的原始意义是指：由植物各种器官的外植体增殖而成的愈伤组织的培养，这是植物组织培养的狭义概念。但植物组织培养经过百余年的发展，至今其范围日益扩大。植物组织培养的广义概念：包括植物及植物器官、组织、细胞和原生质体等植物各种离体生活部份的培养。由于培养物是脱离母体在试管、三角瓶等容器里中培养，所以植物组织培养也称植物的离体培养（culture in vitro）。（二）植物组织培养的分类 一般根据培养材料和方式进行分类。,4,1、根据外植体来源，植物组织培养分为：（1）植株培养：幼苗或较大完整植株的培养。（2）胚胎培养：成熟和未成熟胚胎的培养。（3）器官培养：构成植物体的各种器官的离体培养。包括根茎叶和花、果实等。如茎尖（苗段）培养可以实现良种的快速繁殖。（4）愈伤组织培养：指由外植体脱分化而形成的愈伤组织的培养，即狭义的植物组织培养。愈伤组织可以通过再分化形成植株。（5）组织培养：这里的“组织”，是指植物形态学上的组织。在这里，作为考查外植体来源的组织培养，是指构成植物体各种组织的离体培养。如分生组织、输导组织、薄壁组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层等的离体培养。如茎尖分生组织培养可以生产脱毒苗。,5,（6）细胞培养：能保持良好分散状态的离体细胞或小的细胞团的培养。通常采用液体悬浮培养方法，故又称悬浮培养。细胞悬浮培养主要用于生产植物次生代谢产物。（7）原生质体培养：指植物细胞经过特定酶（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）处理，除去细胞壁后所获得的裸露原生质体的培养。原生质体培养主要用于体细胞杂交，获得体细胞杂种。2、根据培养方式不同，植物组织培养分为：（1）固体培养：通常以琼脂为固化剂。（2）液体培养：包括静止、振荡、旋转培养。,6,植物组织培养的分类：植株培养 胚胎培养 器官培养 培养材料 组织培养（包括愈伤组织培养）细胞培养 原生质体培养 固体培养 培养方式 振荡培养 液体培养 旋转培养 静止培养（包括纸桥培养）,返回,7,二、植物组织培养的生理依据,1、植物细胞的全能性 细胞是植物体的基本结构与功能单位。每个植物细胞含有全套遗传信息，在适宜的外界条件下具有形成完整植株的能力。2、植物细胞全能性学说的提出与证明 1902年，德国著名植物学家Haberlandt认为每个细胞具有植物个体一样的性质和功能，可以通过离体培养，把单个细胞培养成为新个体。并主要对单子叶植物的叶肉细胞、表皮细胞等进行了培养。1934年，美国的White在番茄根尖培养中，建立了第一个活跃生长的无性系。1939年，在烟草茎段愈伤组织培养中，他偶然发现了一个再生的不定芽，并重新提出了植物细胞的全能性学说。1958年，英国的Steward和法国的Reinert在胡萝卜愈伤组织的细胞培养中，经过6年努力获得了完整植株，首先对植物细胞全能性学说给予了科学证明。之后，植物组织培养得到了快速发展。,8,3、为什么植物细胞在适宜的离体条件下能够表现出全能性，而在整体植物上则有形态与功能上的差异呢？处于整体植物中不同部位的生活细胞受到完整植株的控制。为进行植物体的整体生命活动，各部位的细胞在基因表达与阻遏的顺序和成份上存在差异，使某些基因表达，发挥作用，而使另一些基因被阻遏而不表达，从而使完整植株中不同部位的生活细胞只表现出一定的形态和功能，形成不同的组织、器宫。而离体的器官、组织或细胞脱离了整体植株的控制，在适宜的外界条件下（主要受植物激素的调控），细胞恢复分裂与增殖，经愈伤组织再生植株，或直接由胚性细胞产生胚状体（embryoid）再生植株，实现植物细胞的全能性。,返回,9,三、植物组织培养的应用,植物组织培养在生产实践中的应用主要表现在以下几个方面：1、无性系的快速繁殖 兰花，采用组培方法繁殖的已涉及66属以上，并建立了兰花工厂，实现了兰花生产的工厂化和商业化，这方面以荷兰、东南亚国家最为突出。我国广东、广西在香蕉、甘蔗生产上采用组培方法繁殖种苗，提高了产量和品质。无籽西瓜。生产脱毒苗。采用茎尖分生组织培养可以脱除植物病毒，提高种苗质量和作物产量。脱毒苗生产在无性繁殖植物，如香蕉、甘蔗、马铃薯、甘薯、大蒜、草莓、葡萄、康乃馨、柑橘等中尤有应用价值。为什么？建立植物的离体再生体系，是植物基因工程中实现转基因植株大田栽培的基础与前提。,10,2、花药培养与单倍体育种,提高突变育种的工作效率 单倍体只有一套染色体，无显隐性差别，可从表型观察基因型。对其进行理化诱变，基因突变就会导致性状改变，便于隐性突变体的筛选。选择效率高 对单倍体或纯合二倍体的选择是配子选择，从其群体中选择某一基因型的概率是(1/2)n，而从常规F2群体中选择一特定基因型的概率是(1/2)2n(n-参与重组基因数)，所以理论上单倍体育种的效率是常规育种的2n倍。缩短育种周期 纯合二倍体无分离现象，一般只需3年就能获得性状稳定的后代。而常规杂交育种因遗传性状的分离，要获得稳定后代需要多代自交，一般需要8-10年。现已有500多种植物花药培养获得成功。我国也获得了10多中花药植株，如水稻、小麦、玉米、油菜、辣椒、烟草、橡胶等。其中，烟草、水稻、小麦花药植株已经用于生产。,11,3、体细胞杂交和突变体筛选,通过细胞融合，可克服有性杂交（特别是远缘杂交）的不亲和性而获得体细胞杂种，从而创造出新种或育成优良品种。在Carlson等（1972）率先获得烟草种间体细胞杂种，现已实现矮牵牛、曼陀罗和胡萝卜等的种内和种间、烟草马铃薯、胡萝卜羊角芹、雀麦苜蓿等的远缘体细胞融合，并获得其杂种植株。若能实现豆科禾本科，C3C4植物的体细胞融合并获得杂种植株，将具有重大的理论与实践意义。细胞突变体筛选，是采用理化诱变方法，改变植物细胞的遗传性状，从中筛选出对人类有用的突变体，进而育成新品种。用此方法已筛选到一些作物的抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮杆高产突变体，并已用于生产。,12,4、植物次生代谢产物的生产,植物细胞的大规模培养，可能生产蛋白质、脂肪、糖类、香料、染料、药物等；结合突变体筛选，有可能提高有用物质含量。目前，部分植物的细胞悬浮培养采用了13 t 以上的大罐发酵。从培养物中产生的药用成份已有200多种，其中20多种的含量超过或接近原植物。人参组培在中国、日本、美国、德国、俄罗斯等国都已开展，培养物人参皂甙含量（干重），愈伤组织21.1%，分化根为27.4%，而天然根只为4.1%。郑光植从云南萝芙木（“三分三”）愈伤组织中得到降压灵，生物总碱含量达干重的1.48%，利血平含量达0.08%。印度的Khanna用苦瓜种子直接体外培养提取胰岛素，培养物胰岛素含量大1.9%（鲜重）（原植物1.0%），这一成果很快在美、英、德、日等八国取得专利。,返回,13,四、植物组织培养的操作技术,决定植物组织培养成败与效果的关键因素有二：培养基、无菌操作。植物组织培养技术中最关键的技术是无菌操作技术！根据操作的先后顺序，可以把植物组织培养过程分以下三大步骤：培养基配制 接种 培养,14,植物组织培养过程 培养基配制 接种 培养（取材）接种室、超净工作台清洁、消毒 植物材料的表面消毒 无菌操作（接种）,返回,15,1、培养基配制,（1）培养基母液的配制 植物组培常用基本培养基有：MS、White、B5、N6等无机盐：大量元素：100 微量元素（Ca盐、Fe盐单配）：1000有机物：维生素（VB1，等）：100-1000 氨基酸（甘氨酸，等）：100-1000生长物质：2,4-D、NAA、IBA：500-1000 6-BA、KT、ZT：500-1000,16,（2）培养基的配制吸取母液加入琼脂：0.6-0.8%加热溶解加入蔗糖：2-3%定容调pH（MS=5.8）分装（3）培养基的消毒 排冷气、放气,返回,17,2、接种,2.1 取材 生长季节取材 晴天取材 内部组织2.2 接种室、超净工作台清洁、消毒 操作者 接种室 超净台,18,2.3 植物材料的表面消毒 常用消毒剂：70-75%乙醇：30 s 0.1-0.2%升汞：5-10 min 2-5%次氯酸钠：5-10 min 饱和漂白粉上清液：5-10 min 培育无菌苗2.4 无菌操作（接种）接种工具：镊子、手术刀、剪刀 接种区域：接种方法：叶片、顶芽、茎段,返回,19,3、培养,温度光照：愈伤的培养、生根；光自养培养湿度,返回,20,五、试管苗移栽,晾苗炼苗移栽：温度、湿度的控制,返回,