植物生物学实验10植物种子生命力的快速测定.ppt
实验十、种子生命力的快速测定,南京师范大学 生命科学学院,植物生物学实验（二）,种子生命力 指种子的萌发能力。种子生命力测定的常规方法 发芽实验、浮力实验,种子生命力快速测定的常用方法,BTB法、,TTC法、,红墨水法,以及荧光法、纸上荧光法、电导率测定法、冷冻测定法等,二、知识背景,三、测定方法,BTB法TTC法红墨水法荧光法,1、BTB法原理,凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的O2，放出CO2。CO2溶于水成为H2CO3，H2CO3解离成H+和HCO3-，使得胚周围环境的pH值降低，可用酸碱指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）来测定pH值的改变。,颜色变化越明显则表明种子活力越强。死细胞没有呼吸作用，也没有BTB的颜色变化。,BTB法试剂,0.1%BTB 溶液：0.1g溶解于煮沸过的自来水100mL中，用滤纸滤去残渣。溶液若呈黄色，可滴加稀氨水或NaOH溶液，使之呈现蓝色或蓝绿色，棕色试剂瓶中保存。,BTB琼脂凝胶：取1g琼脂煎碎后加入100mL 0.1%BTB溶液中，用小火加热并不断搅拌。待琼脂完全溶解后，趁热倒在干燥洁净的培养皿中，使之为一均匀的薄层，冷却后备用。,BTB法材料与设备,恒温箱、培养皿、小麦或绿豆,BTB法步骤,浸种：将待测种子在30温水中浸种24h。倒平板：取预先加热融化的BTB琼脂凝胶倒入培养皿，静置冷却，使之形成凝胶薄层。,显色：取吸胀的种子，整齐地将胚向下埋于准备好的BTB琼脂凝胶培养皿中，间隔距离在1cm左右。然后将培养皿置于恒温培养箱中30-35培养1h。,BTB法步骤,1h后，记数种胚附近出现的黄色晕圈的活种子数，计算活种子的百分率。,2、TTC法原理,凡是有生命活力的细胞均具有呼吸作用，从而都有氧化还原反应，而死细胞则无此反应。,TTC（氯化三苯四氮唑）可渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原，此时无色的TTC便转变为红色的TTF（三苯基甲曁），并吸附在活细胞的表面，根据活细胞着色的深浅可定性的判断种子活力的有无与大小。,该方法在国际间、地区间交换种子最为常用。,注意：染色部位为生活种子的胚细胞。,TTC法试剂,0.5%TTC溶液：0.5gTTC（酒精溶解后）定容至100ml，棕色瓶4保存。,若溶液变成红色，表示已被氧化不能再用。,TTC法材料与设备,恒温箱、培养皿、玉米种子、刀片,TTC法步骤,浸种：同BTB法。,显色：取吸胀的种子适量，用刀片沿胚的中心线纵切为两半，将每一种子的半粒置于培养皿中，另半粒待用。加入适量的0.5%TTC溶液（以浸没种子为度），置于30恒温箱中；1h后，倒去染色液，观察现象。,计算活种子的百分率。,将待测种子在30温水中浸种24h。,3、红墨水法原理,活细胞的原生质膜具有选择透性，红墨水中的染色成分大红G不能进入细胞；因而胚不被红墨水染色。,死亡的种胚细胞原生质膜丧失选择透性，大红G进入胚细胞并染色。,注意：生活种子的胚细胞不染色。,红墨水法试剂,5%红墨水：以市购红墨水为原液，用自来水配制成5%的红墨水溶液,红墨水法材料与设备,恒温箱、培养皿、玉米种子、刀片,红墨水法步骤,浸种：同BTB法。,显色：将TTC法中剩余待用的一半种子置于另1只培养皿中，加入适量的5%红墨水液（以浸没种子为度）。15min后倒去红墨水，用自来水冲洗多次，直至冲洗液为无色为止。观察现象，判断种子活力的有无和大小。,计算活种子的百分率。,将待测种子在30温水中浸种24h。,红墨水法,活种子,死种子,4、荧光法原理,植物种子中常含有一些物质，能在紫外线照射下产生荧光，如黄酮类、香豆素类、酚类等。在衰老过程中：荧光物质的结构、成分往往发生变化，因而改变荧光的颜色。可借助直接观察荧光来鉴定种子的生命力。适用于禾谷类、松柏纲等植物的种子。细胞膜透性增加，导致浸种后荧光物质外泄，可通过观察荧光物质的渗出情况判断种子的生命力。适用于十字花科植物的种子。,荧光法材料与仪器,玉米种子。紫外光灯，不产生荧光的滤纸。,荧光法步骤,随机取20粒种子，用刀片将玉米种子沿中心线切为两半，使其切面朝上放在滤纸上，置于紫外光灯下照射观察。有生命力的种子将产生明亮的蓝色、蓝紫、蓝绿 色荧光。死亡种子往往呈黄色、褐色，并暗淡无光。观察、计数，计算活种子的百分率。,荧光法,观察孔,紫外分析仪,电源,选择波长,思考题,1、试比较TTC法、BTB法、红墨水法及荧光法，测定的结果是否相同?为什么?哪一种方法更准确？它们与种子的实际萌芽率是否一致？如若有偏差，理论上应为偏高还是偏低？为什么？,2、BTB法测定种子发芽率时，若用煮死的种子做比较，有时也发现在种子周围出现黄色晕圈，为什么？3、如果用以上各方法来进行实验观察没有完全成熟的种子，将会有怎样的结果？,思考题,纸上荧光法,原理：凡有生活力的种子和已经死亡的种子，它们的种皮对物质的透性是不同的，而许多植物的种子中又都含有荧光物质。利用对荧光物质的不同透性来区分种子的死活，方法简单，特别是对十字花科植物的种子，尤为适用。,死种子,活种子,冷冻测定法打破种子休眠,
