植物工厂化育苗的工厂与设备.ppt

植物工厂化育苗的工厂与设备,2,第一节 实验室,一、实验室,植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。,准备室,培养室,温 室,Text,实验室,接种室,接种室,实验室组成：,4,基本实验室布局平面图,实验台,搁架,培养架,培养架,培养架,培养架,药品及仪器柜,无菌台,无菌台,搁架,拉窗,冰箱,搁 架,水槽,电炉,门,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,准备室,缓冲室,无菌室,培养室,准备实验室,5,缓冲室,6,无菌室,7,无菌室,8,9,9,无菌室,10,10,11,11,培养架,12,12,培养室,13,温室,14,14,第二节 仪器与设备,15,冰箱,酸度计,电炉,1.基本设备,17,天平,纯水器,18,搅拌器,19,蒸汽压力灭菌锅,2.灭菌设备,20,21,22,22,过滤灭菌装置,23,23,紫外灭菌灯管,3、无菌操作设备,超净工作台,24,25,25,超净工作台,无菌接种箱,26,恒温振荡培养箱,光照培养箱,4、培养设备,27,摇 床,28,5、细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜,29,倒置显微镜,光学显微镜,30,1、玻璃器皿,三、培养器皿及实验用具,培养皿,三角瓶,培养瓶,2、金属材质用具,镊子,解剖刀,接种针,32,接种盘,33,33,第二节 培养基,培养基是决定植物组织培养成败的关键因素之一。培养基的构成要素通常可分为：水分；无机盐类；有机营养成分；植物生长调节物质；天热物质；pH；凝固剂等。,34,34,构成培养基的绝大部分组分为水分。在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。,（一）水分,大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种,按照国际植物生理协会的建议：所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素,35,（二）矿质元素,1.大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,36,Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2、微量元素 在微量元素中，铁的使用最大：一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀,38,硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长 锰参与植物的光合、呼吸代谢 钼参与氮素的代谢 氯是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,39,（三）有机营养成分,培养基中的有机营养成分包括糖类物质、维生素类 和氨基酸类。,1.碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：具有热易变的性质 利于吸收和利用 使用浓度一般在2%5%提供能源和调节渗透压,41,2.维生素类,以各种辅酶的形式存在 参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6,42,蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是甘氨酸,3.氨基酸,43,4.肌醇,环己六醇 细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 促进活性物质发挥作用,44,（四）植物生长调节剂,植物生长调节剂不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成。最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。,1.生长素类,促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素：IAA(吲哆乙酸)NAA(萘乙酸)2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸),46,2.细胞分裂素类,促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控 溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素：KT(激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(异戊烯氨基嘌呤)ZT（玉米素）,47,3.赤霉素类和脱落酸,A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力,GA3,脱落酸,48,促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂 天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,（五）天然复合物,49,50,（六）pH,在灭菌前，培养基的pH一般被调节到5.06.0之间，最常用的pH为5.75.8。pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固。,50,（七）凝固剂,琼脂是使用最普遍的凝固剂用量一般在6-10g/L之间颜色以浅、透明度高好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。,51,（八）其他添加物,52,1.活性炭,吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化 促进生根 2.抗生素 防止外植体内生菌造成的污染,活性炭,53,53,二、培养基的基本类型,培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基,（一）培养基的种类,成分和浓度不同：含盐量较高的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含量的培养基,54,54,1、MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物,（二）几种常见培养基的特点,2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,附表：White培养基,56,3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,B5培养基的组成和配方,57,4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含钼,N6培养基组成及配方,58,第三章 培养基和培养条件,为了减少工作量，减小误差，最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液。,一、培养基母液的配制,60,1.配制母液原则 相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。,61,2.MS培养基母液的配制,62,MS培养基母液根据试剂特性通常配成五种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe盐（100倍）、Ca盐（50倍）、有机物（100倍）。,63,3.激素母液的配制,64,生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95乙醇溶解；细胞分裂素类用1N HCl或1N NaOH溶解。通常激素母液浓度生长素类为0.10.5 mg/ml,细胞分裂素母液浓度为0.21.0 mg/ml.,二、培养基的配制,水,药品,糖,琼脂,混合,加热溶解,调整pH,玻璃器皿,水洗,干燥,分装,灭菌,封口,冷却,接种,1、取出母液并按顺序放好。将洁净的各种玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置；2、取一只容量瓶，放入配制培养基总量的1/3左右纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；3、加入植物生长调节剂后定容；,培养基的配制的具体步骤：,4、将定容的培养基倒入容器中，加入蔗糖和琼脂，并加热使其完全溶解；5、调整pH；6、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；7、灭菌，用高压锅灭菌（121，1520min）或过滤除菌；8、灭菌后待高压锅温度下降到50以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。,68,69,三、培养基的保存,配制好的培养基一般要在室温、黑暗且清洁的地方放置35天再使用。保存时间太久，培养基可能会污染、脱水、易分解的成分会发生分解，培养基成分会发生较大的变化。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。,四、培养条件,71,温度光照湿度气体培养基的渗透压pH值,植物材料一般最适温度在252之间,环境条件,光强：10006000 lx,一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%80%,氧气是愈伤组织生长所必需的,调节渗透压常常从糖入手,植物组织培养时培养基的pH值大多在5.06.5,光质：影响细胞分裂和器官分化,光周期：光照16h，黑暗8h,第三节 基本操作,一、洗涤,1、玻璃器皿洗涤,新购置玻璃器皿,1%稀HCl,浸渍12h,洗衣粉洗涤,清水冲洗,晾干备用,已用过的玻璃器皿,2、塑料用品洗涤,塑料器皿,2%NaOH浸泡12h,清水冲洗,2%5%盐酸浸泡30min,清水冲洗,蒸馏水冲洗,晾干备用,73,3、金属用品洗涤,热洗衣粉水洗净,冲洗,擦干,74,75,1.灭菌方法：（1）物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等（2）化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌,75,二、消毒灭菌,2、灭菌,（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104Pa 温度在121 灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌,76,饱和蒸汽压力与其对应的温度,77,（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用,（5）过滤灭菌：一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素。,78,（6）接种室灭菌,空气消毒灭菌,接种室,超净工作台,紫外灯照射,70%75%的酒精擦洗,培养材料的接种,紫外灯照射,79,（7）外植体灭菌,流水冲洗1020min或更长时间,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右,蒸馏水冲洗45次,在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右,备用,80,常用消毒剂消毒灭菌比较表,81,82,熏蒸灭菌 常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时，房间关闭紧密，按68ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加克高锰酸钾促进挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。,82,（8）培养室灭菌,三、无菌操作,实验员消毒,实验室、无菌台灭菌,实验器材的灭菌,无菌接种,消 毒,实验台卫生,培养室培养,83,1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。,84,5、用沾有70%75%酒精的纱布或脱脂棉擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。,85,9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。,注意：操作期间应经常用70%75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。,86,87,88,