脓汁和粪便标本中病原菌的检测4.ppt
斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。,器材准备,染色瓶6组，染色架8个。,医学微生物学实验综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四）斜面培养物的观察革兰染色法肉汤接种法显微镜油镜的使用,斜面培养物的观察,从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色紫黑或粉红。从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻刮一下即可。,细菌染色法,单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。,结核分枝杆菌抗酸染色,麻风分枝杆菌抗酸染色,产气荚膜梭菌荚膜Hiss 染色,破伤风梭菌芽胞芽胞染色,变形杆菌鞭毛Leifson染色,白喉棒状杆菌异染颗粒Albert染色,革兰染色法 Gram Staining 革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。,革兰染色法原理的三种学说,通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫碘复合物容易被酒精脱出。等电学说：G+菌等电点(pH23)比G-菌(pH45)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。,革兰染色的意义鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。选择抗菌药物：G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。革兰染色的步骤 涂片 干燥 固定 染色,接种环取生理盐水34ul，2滴。,菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2。,涂毕环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂接种环烧灼灭菌。,涂片的制备,甲黄色，紫黑。乙白色，粉红。丙黄色，紫黑。丁白色，粉红。,细菌合适,细菌较多,涂片,干燥,固定 Fixation,手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间23秒钟。,促使蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。,革兰染色方法步骤,涂片 干燥 固定 结晶紫 初染1分钟水洗 卢戈碘液媒染1分钟水洗 95乙醇脱色约20秒钟水洗 稀释复红复染1分钟水洗 吸干,镜检。取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。,革兰阳性菌 革兰阴性菌,G+链球菌,G-双球菌,G+杆菌,G+短杆菌,G-弧菌,G-螺菌,液体培养基接种 Broth Transfer 悬浮法 Suspending Method,甲黄色,乙白色,丙紫黑,丁粉红。标记：组号，颜色,37培养4小时,45108cfu/ml,接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种。,在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。,生物安全警告,本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,显微镜油镜的使用P13,10物镜看清楚标本滴加香柏油100油镜浸泡油中（几乎与标本接触，工作距离0.13mm）模糊物象细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源。将聚光镜调到最高处；孔径光阑环上刻有的物镜倍率（10，100）必须转到正面，与使用的物镜相对应。油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。显微镜罩上防尘罩 横放在实验柜内。(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。,100倍浸油物镜使用方法,油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过12次浸油，排除油内气泡。,温馨提示,因染色场地受限，15组先涂片染色，后接种肉汤。610组先接种肉汤，后涂片染色。待染色和肉汤接种完毕，桌面收拾干净，才可镜检，以免污染。镜检过的载玻片不必擦拭，直接投入玻片缸内消毒、灭菌。,革兰染色法P15 甲黄色，紫黑 乙黄色，紫黑 丙白色，粉红 丁白色，粉红肉汤接种法P10 甲黄色 乙白色 丙紫黑 丁粉红油镜的使用P13 10物镜看到标本滴加香柏油100油镜浸泡油中模糊物象细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。聚光镜孔径光阑环上的物镜倍率（10或100）必须转到正面。,思考题,革兰染色法的关键步骤是什么?为什么?染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物?如何使用油镜?,实验小结用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。,葡萄球菌（电镜）,黄色、白色形态与染色（油镜）,酸葡萄,黄色、白色菌落特征,黄色,白色,用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。,杆菌（电镜）,紫黑、粉红细菌的形态与染色（油镜）,紫黑,紫黑、粉红菌落特征,粉红,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验器材 整齐有序,革兰染色瓶,染色架,石蜡油,拭镜纸,吸水纸,乙醇乙醚,微生物学器材柜-1（边台西侧中段）,染色、镜检器材收拾入柜依次摆整齐,
